羅伊氏乳桿菌凍干保護劑的優(yōu)選及高密度凍干工藝優(yōu)化

譚莎莎，馬方勵，崔樹茂*，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州， 510623)

羅伊氏乳桿菌是目前報道的可存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸桿菌[1-2]，它能夠很好地黏附在腸黏膜上，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高免疫力,促進人體健康[2]。乳酸菌通常采用真空冷凍干燥進行制備。真空冷凍干燥是將被干燥物料中的水凍結(jié)成冰，然后使冰升華而除去水的一種干燥方法[3]，其基本原理是在低溫低壓下傳熱傳質(zhì)[4]。但是菌體在冷凍干燥過程中會有損傷，主要包括機械損傷和溶質(zhì)損傷。機械損傷是由于低溫時細胞內(nèi)外冰晶生長產(chǎn)生的機械力量導(dǎo)致的。溶質(zhì)損傷則是由于凍結(jié)過程中細胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，電解質(zhì)的濃度明顯增大造成的，進而增加了細胞死亡的可能性[5-6]。因此在冷凍干燥過程中需要加入凍干保護劑來提高凍干后活菌數(shù)。

最常使用的保護劑有糖類、蛋白質(zhì)、聚合物等，這些不同分子質(zhì)量的保護劑以不同的途徑保護著菌體，例如低聚糖等通過穿過細胞壁但不穿過細胞質(zhì)膜的方式保護著菌體，甘油等通過穿過細胞壁和細胞質(zhì)膜的方式保護著菌體，蛋白質(zhì)等能在菌體表面形成蛋白膜，避免菌體暴露于外界環(huán)境中遭到損傷[7-8]；另外，還有其他一些物質(zhì)可能會加強凍干保護劑的保護效果?？寡趸镔|(zhì)能降低保護劑的氧化還原電位, 并消耗試驗過程中的部分氧氣[9]；無機鹽類能滲透進入細胞內(nèi)部，從而使胞內(nèi)電解質(zhì)溶液的濃度升高，進而減少溶質(zhì)損傷[10]；氨基酸能作為pH調(diào)節(jié)劑以防止因pH變化導(dǎo)致的大分子物質(zhì)變性[11]；GSH能維持細胞膜的較高的不飽和度比和飽和脂肪酸的短鏈長度，從而獲得完整的細胞結(jié)構(gòu)[12]；谷氨酸鈉能與水密切作用使干粉保留適量的水分，滿足微生物維持生命的最低需求[13]；甜菜堿則能夠調(diào)節(jié)細胞滲透壓和離子平衡[14]。通常認為不同保護原理的保護劑復(fù)合后會提高菌體的凍干存活率，因此目前乳酸菌的冷凍干燥配方一般混合了多種保護劑即復(fù)合保護劑。但不同乳酸菌的凍干保護研究參差不齊，無規(guī)律可循。本文系統(tǒng)研究所有類保護劑，總結(jié)規(guī)律為乳酸菌凍干保護劑的選擇提供明確且簡便的方法。

真空冷凍干燥是一個高能耗過程，如何降低乳酸菌制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的能耗也是凍干研究的重要目標?，F(xiàn)代工業(yè)中，乳酸菌凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量(即凍干結(jié)束干粉得率)通常在15%～20%。提高凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量，可減少菌懸液的體積，從而降低凍干機的使用面積，降低能耗。本文將在得到最優(yōu)保護劑的基礎(chǔ)上優(yōu)化凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量，實現(xiàn)高密度凍干，減少凍干機的使用面積以實現(xiàn)降低凍干能耗的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌138-1 (Lactobacillusreuteri138-1)(CCFM8631)，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

實驗所用的MRS培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；巖藻糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、水蘇糖、山梨糖醇、甘油、赤蘚糖醇、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、抗性糊精、乳清蛋白、膠原蛋白、脫脂乳、谷氨酸鈉、甜菜堿、硫酸錳、硫酸鈉、谷胱甘肽、抗壞血酸等，創(chuàng)賽生物科技有限公司；復(fù)合維生素，惠氏制藥有限公司；復(fù)合核苷酸(A、C、T、G)，山西萊克生物科技有限公司；腺嘌呤(A)，購自南京鑫越源生物科技有限公司；味之素(I+G)，興化市味之素食品配料有限公司；胰蛋白胨，鄭州盛仁堂生物科技有限公司；大豆蛋白胨，安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；FE20型pH計、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；泰事達凍干機，西班牙Telstar公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

將置于-80 ℃的甘油保菌管取出，解凍。用接種環(huán)沾取菌液后在MRS固體培養(yǎng)基上平板劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。用接種環(huán)從平板上長出的菌落中挑取單菌落，將其接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取200 μL再次接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后得到活化后的種子液。

1.3.2 羅伊氏乳桿菌的凍干

以8%的接種量接菌至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后8 000×g、4 ℃、20 min離心，去上清。將菌泥與水按質(zhì)量比1∶1混勻后調(diào)pH至6.5左右，再將菌懸液以體積比2∶1與保護劑溶液混合，充分均勻后取1 mL分裝至凍干瓶凍干。

凍干工藝：預(yù)凍，控制層板1 h內(nèi)降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.3 保護劑溶液的配制

(1)不同種類保護劑

分別準確稱取糖(醇)類、蛋白質(zhì)類、聚合物類等各類保護劑20 g，溶解后用蒸餾水定容至100 mL，即保護劑溶液質(zhì)量濃度為200 g/L。

(2)不同分子量保護劑的復(fù)配

保護劑A(質(zhì)量比1∶1復(fù)配)：復(fù)合保護劑以兩種保護劑復(fù)配且兩者之間1∶1復(fù)配，即各100 g/L。

保護劑B(不同質(zhì)量比復(fù)配)：m(低聚異麥芽糖)：m水蘇糖=1∶2時，低聚異麥芽糖70 g/L，水蘇糖140 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=2∶1時，低聚異麥芽糖140 g/L,水蘇糖70 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=1∶3時，低聚異麥芽糖50 g/L,水蘇糖150 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=3∶1時，低聚異麥芽糖150 g/L,水蘇糖50 g/L。

(3)優(yōu)勢保護劑復(fù)配其他類保護劑

低聚異麥芽糖120 g/L,水蘇糖60 g/L,其他類保護劑30 g/L。

糖類保護劑在115℃條件下滅菌20 min，蛋白質(zhì)和聚合物類保護劑在85℃條件下滅菌30 min。

1.3.4 羅伊氏乳桿菌的高密度凍干

以8%的接種量接菌至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后8 000×g、4 ℃、20 min離心，去上清，收集菌泥。選取優(yōu)化后的凍干保護劑配方配制保護劑，將菌泥干物質(zhì)和保護劑干物質(zhì)以質(zhì)量比1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2分別配制成質(zhì)量分數(shù)為9%、17%、23%和29%的凍干體系，分別取1 mL分裝至凍干瓶凍干。凍干工藝同1.3.2。

1.3.5 凍干存活率的測定[15]

將凍干后的菌劑用無菌蒸餾水還原到凍干前的質(zhì)量，混勻后測定其中的菌落總數(shù)凍干存活率如公式(1)所示：

(1)

式中：活菌數(shù)的單位為CFU/mL。

1.3.6 凍干前后樣品的活菌計數(shù)

采用活菌計數(shù)法[16]，取0.5 mL菌液以10倍依次遞增稀釋至3個合適稀釋度，各取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中，將已溶化并冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基傾注15 mL至培養(yǎng)皿中，立即放在桌上手動搖晃混勻，每個稀釋度做3個平行，凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h取出并記錄活菌數(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗中每個實驗值的測定均為3次平行實驗的平均值，在后期的統(tǒng)計分析中不再重復(fù)強調(diào)。不同組(>3)之間的顯著性差異通過進行ANOVA進行判斷(Tukey’s檢驗)，兩組之間的顯著性差異通過t檢驗進行判斷(SPSS 16.0軟件)，P<0.05則認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類凍干保護劑的保護特性

羅伊氏乳桿菌在不同種類保護劑中的凍干存活率如表1所示。

表1 羅伊氏乳桿菌在不同種類保護劑中的凍干存活率Table 1 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteri in different types of protective agents

注：表中不同字母代表顯著性(P<0.05)；a～o代表凍干存活率大～小

目前最常用的保護劑有糖(醇)類、蛋白質(zhì)類以及聚合物類。糖(醇)類保護劑具有多個羥基，可替代水分子在冷凍干燥過程中與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或與菌體蛋白質(zhì)極性基團形成氫鍵，避免細胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性受到破壞[5,17]；蛋白質(zhì)類的保護劑能在菌體表面形成蛋白膜，穩(wěn)定菌體細胞膜，為菌體提供了保護衣，保護菌體不因暴露于外界環(huán)境中而受到損傷[8，18]。它也為凍干的菌體提供了疏松、多孔的結(jié)構(gòu)[19-20]；聚合物類保護劑則可以顯著提高生物制品混合溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，抑制冷凍干燥過程中pH值的劇烈變化等。通常認為不同保護原理的凍干保護劑復(fù)合提高菌體的凍干存活率，這也為下面開展不同分子量的凍干保護劑復(fù)配奠定了基礎(chǔ)。

為了系統(tǒng)探究這些糖(醇)類、蛋白質(zhì)類、聚合物類保護劑對乳桿菌的凍干保護效果，將文獻報道過的糖(醇)類、蛋白質(zhì)類、聚合物類保護劑進行單因素實驗，由表1可知，37種不同保護劑中大部分的保護效果均顯著高于無菌水的對照樣(P<0.05)，低聚糖的凍干保護效果最好，羅伊氏乳桿菌138-1在不同低聚糖保護下的凍干存活率均達到60%左右。

由上述實驗結(jié)果可知不能滲透進細胞壁的蛋白質(zhì)和聚合物的凍干保護效果不好，這可能是由于大分子保護劑是通過“包裹”的形式保護菌體的，所以不能像有些糖(醇)類保護劑那樣可以滲透進細胞壁，在細胞壁和細胞膜之間形成一層糖(醇)溶液保護層，保護細胞膜的功能和完整性。而通常認為的可滲透進細胞膜的赤蘚糖醇、甘油的凍干保護效果也不好，充分說明乳桿菌的凍干過程細胞膜的保護是關(guān)鍵因素。不同分子量的糖(醇)類物質(zhì)隨著分子量的增大，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度升高，更有利于菌體的凍干存活。因此相同濃度下低聚糖較單糖表現(xiàn)出更優(yōu)的保護效果。

2.2 不同分子質(zhì)量的凍干保護劑復(fù)配對菌體的影響

2.2.1 不同分子質(zhì)量保護劑以質(zhì)量比1∶1復(fù)配對菌體凍干存活的影響

羅伊氏乳桿菌在不同分子量變合保護劑中的凍干存活率如表2所示。

表2 羅伊氏乳桿菌在不同分子量復(fù)合保護劑中的凍干存活率Table 2 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteri in different molecular weight complex protective agents

注：*代表與低聚異麥芽糖相比的顯著性，*代表P<0.05，**代表P<0.01，****代表P<0.000 1(下同)

通過分析不同種類的凍干保護劑對羅伊氏乳桿菌的凍干保護作用，證實了大小分子對其保護方式是不一樣的。那么單一保護劑與復(fù)合保護劑是否具有相同的凍干保護效果呢？焦琳等[21]在優(yōu)化嗜熱鏈球菌M5-5菌體細胞的凍干保護劑時選取了3種保護劑，包含小分子保護劑海藻糖、甘油和大分子保護劑：脫脂乳。發(fā)現(xiàn)海藻糖、甘油和脫脂乳作為單一凍干保護劑時，菌體細胞存活率最高為47.51%，但應(yīng)用通過正交試驗確定的大小分子復(fù)合保護劑配方后菌體的凍干存活率可達88.41%，提高了2倍左右。袁亞宏和韓德權(quán)等[22-23]對保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌的凍干保護劑進行優(yōu)化也得出了相似結(jié)論。這些都證明了單一的保護劑并不能滿足冷凍干燥和菌體抵抗外界惡劣條件的要求，所以一般都是按一定配方混合使用。

因此選取不同分子質(zhì)量的保護劑，大分子(抗性糊精)、低聚糖(低聚異麥芽糖、水蘇糖)和小分子糖(海藻糖、乳糖)兩兩復(fù)配進行羅伊氏乳桿菌138-1的凍干。復(fù)配后的組別較單一低聚異麥芽糖組沒有顯著性提高，并不和大部分文獻中提出的觀點相同，多種保護劑混合運用效果更好，而且發(fā)現(xiàn)如果復(fù)配一個效果不好的保護劑反而會降低保護效果。低聚糖和不同低聚糖的復(fù)配依然呈現(xiàn)出最好的凍干保護效果。

2.2.2 不同低聚糖以不同比例復(fù)配對菌體凍干存活的影響

羅伊氏乳桿菌在不同低聚復(fù)合保護劑中的凍干存活率如表3所示。

表3 羅伊氏乳桿菌在不同低聚糖復(fù)合保護劑中的凍干存活率Table 3 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteriin different molecular weight complex protective agents

注：無顯著性差異(P>0.05)

多數(shù)研究表明，復(fù)合保護劑因具有不同特性的保護劑，一般情況下按一定比例混合使用后可明顯提高凍干保護效果[24]。但由表3可知，分別將2種低聚糖之間的質(zhì)量比調(diào)整為1∶2、2∶1、1∶3以及3∶1，凍干存活率之間的差異性并不明顯，為60%左右。由此可知道，不同低聚糖以不同比例復(fù)配，不影響整體凍干效果。這也進一步證實了低聚糖作為凍干保護劑的優(yōu)勢假設(shè)。

2.3 優(yōu)勢保護劑復(fù)配其他類物質(zhì)對菌體凍干存活的影響

正如前言所述，凍干保護劑最常用的為糖類、聚合物、蛋白質(zhì)等，但還有其他一些可能加強凍干保護效果的物質(zhì)，這些物質(zhì)以不同的原理對菌體有一定的保護效果。羅伊氏乳桿菌在優(yōu)勢保護劑復(fù)配其他類物質(zhì)中的凍干存活率如表4所示。將這些可能加強凍干保護效果的物質(zhì)與低聚糖復(fù)配之后，可以發(fā)現(xiàn)有的組別的凍干存活率有所提高，但并不顯著。保護效果最好的組合為低聚異麥芽糖+水蘇糖+復(fù)合核苷酸(I、G)，凍干存活率為(66.44±2.46)%。而且依舊發(fā)現(xiàn)復(fù)合保護劑的保護效果較單一保護劑的保護效果沒有顯著性的提高。由此可知，低聚糖的凍干保護效果較好，復(fù)配其他已有文獻報道的對菌凍干保護起積極作用的物質(zhì)未表現(xiàn)出凍干保護效果的提升。

表4 羅伊氏乳桿菌在優(yōu)勢保護劑復(fù)配其他類物質(zhì)中的凍干存活率Table 4 Freeze-drying survival rate of Lactobacillusreuteri in other protective substances

2.4 菌株的高密度凍干

冷凍干燥需要的時間較長，通常乳酸菌的凍干需要72 h左右，這使得凍干菌制劑的成本高，發(fā)展受到限制。另外，在全球能源緊缺的今天，節(jié)能降耗亦成為工業(yè)發(fā)展中不可忽視的問題。然而，凍干制品具有多重優(yōu)越性，所以降低乳酸菌制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的能耗成為凍干研究的熱點之一。提高凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量，可減少菌懸液的體積，降低凍干機的使用面積和能耗。

羅伊氏乳桿菌在高密度凍干下的存活率如表5所示。由表5可知，m(菌泥干物質(zhì))∶m(保護劑干物質(zhì))為1∶1.2時效果最好，凍干存活率普遍達到90%左右。也就是說凍干樣品中保護劑干物質(zhì)比菌泥干物質(zhì)多時，才能達到較好的保護效果。現(xiàn)在工業(yè)上普遍采用15%～20%的總干物質(zhì)含量，本次實驗將總干物質(zhì)含量提高到了30%左右，不僅使得能耗大大降低，存活率也保持在了90%以上。制得羅伊氏138-1凍干菌粉活菌含量2 500億/g(2.5×1011CFU/g)。

表5 羅伊氏乳桿菌在高密度凍干下的存活率Table 5 Survival rate of Lactobacillus reuteri underhigh-density freeze-drying

3 結(jié)論

(1)低聚糖較單糖(醇)、二糖、多糖、蛋白質(zhì)和聚合物對羅伊氏乳桿菌具有更好的凍干保護效果，且不同的低聚糖之間無顯著性差異。

(2)不同分子質(zhì)量保護劑復(fù)配后凍干保護效果未顯著提升，且復(fù)配保護效果差的保護劑后凍干保護效果反而降低；低聚異麥芽糖和水蘇糖兩種低聚糖的復(fù)合與單一低聚糖做保護劑的凍干保護效果無顯著差異，且改變兩者的復(fù)配比例后凍干保護效果亦無顯著差異。

(3)低聚糖復(fù)配已有文獻報道的對菌凍干保護起積極作用的物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、抗氧化劑、緩沖劑、核苷酸等，未表現(xiàn)出凍干保護效果的提升。

(4)保護劑干物質(zhì)量高于菌泥干物質(zhì)量時，提高菌體的凍干存活率。菌泥與保護劑干物質(zhì)的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1.2，凍干前菌懸液的干物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)可提高至30%左右，凍干存活率達93.02%。降低了凍干體積，提高了凍干效率。