黑毛組6種石斛藥效成分分析及營養(yǎng)價值評價

王彥兵，周侯光，尹紅星，李慶聰，王曉媛 *，李守嶺 *

1云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，瑞麗 678600；2廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004

石斛屬DendrobiumSw.是蘭科三大屬之一，其原種將近2000種[1]。王雁等著的《石斛蘭》以蘭科分類學(xué)家理查德·施萊赫特的分組系統(tǒng)為架構(gòu)，采用被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)同的分類變更，將石斛蘭屬整理為5個亞屬40個組[2]。石斛早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，具有養(yǎng)陰生津、潤肺明目、抗癌防老等功效[3]，此外，石斛還是優(yōu)良的植物蛋白來源，具有較高的藥用食用價值[4]?！吨腥A人民共和國藥典》(2015年版)收錄了鐵皮石斛D.officinale、金釵石斛D.nobile、流蘇石斛D.fimbriatum、鼓槌石斛D.chrysotoxum及其同屬近似種的新鮮或干燥莖作為中藥石斛的來源[5]。由于石斛資源珍稀及收集困難，目前國內(nèi)外關(guān)于石斛的研究主要集中在石斛組Sect.Dendrobium(如鐵皮石斛、金釵石斛、齒瓣石斛D.devonianum)和頂葉組Sect.Chrysotoxae(如鼓槌石斛、密花石斛D.densiflorum)等幾種廣為人知的藥用石斛種質(zhì)上，對于其它石斛的研究相對較少。

黑毛組Sect.Formosae石斛因其幼時葉片和葉鞘覆蓋黑色短毛而得名，作為珍稀石斛種質(zhì)資源，我國境內(nèi)共發(fā)現(xiàn)7種自生種。目前，國內(nèi)外對黑毛組石斛的研究較少，主要集中在種質(zhì)資源收集[6,7]、雜交育種[8,9]、組間鑒別[10,11]、成分鑒定[12-14]等方面，而關(guān)于其藥效成分及營養(yǎng)價值評價的研究鮮有報道。本研究以黑毛組6種石斛為材料，對其藥效成分多糖、醇溶性浸出物、石斛堿及17種氨基酸含量進(jìn)行測定，并分析以上指標(biāo)之間的相關(guān)性，旨在為篩選優(yōu)良石斛種質(zhì)和開發(fā)石斛資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試材料均采自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部瑞麗石斛種質(zhì)資源圃保存的原生種石斛，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所李標(biāo)研究員鑒定，詳情見表1。其中翅梗石斛、長距石斛、翅萼石斛為國內(nèi)原生種，美麗石斛、龍骨石斛、處子石斛為國外原生種。供試材料于55 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后過50目篩備用。

1.2 儀器與試劑

RETSCH MM400組織磨樣器，濟(jì)南泰和盈科商貿(mào)有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；D-37520 型高速離心機(jī)，德國Heraeus公司；ME204電子分析天平，上海恒勤儀器設(shè)備有限公司；TGL20MW臺式冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；Biochrom30+全自動氨基酸分析儀，大昌華嘉商業(yè)(中國)有限公司；SN251668生物芯片分析儀，美國伯騰公司；6890N氣相色譜儀，安捷倫；G2X-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

葡萄糖對照品，批號110833-200904，中國食品藥品檢定研究院；石斛堿對照品，批號17012003，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；萘、苯酚、無水乙醇、氯化鈉等，國產(chǎn)分析純；檸檬酸鈉、茚三酮及甲醇(色譜純)為進(jìn)口試劑。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量測定

參照2015年《中華人民共和國藥典》(一部)鐵皮石斛項下多糖含量測定方法進(jìn)行測定[5]。

1.3.2 醇溶性浸出物含量測定

參照2015年《中華人民共和國藥典》(一部)通則2201項下熱浸法提取測定[5]。

1.3.3 石斛堿含量測定

參照2015年《中華人民共和國藥典》(一部)金釵石斛項下測定方法分析測定[5]。

1.3.4 氨基酸含量測定

參照Wang等[4]方法，稱取樣品粉末0.2 g( 精確到 0.000 1) 于10 mL安剖瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，測定除色氨酸以外的 17 種氨基酸。

1.3.5 營養(yǎng)評價方法

參考Zhu等[15]提出的方法計算氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行重復(fù)測定3次，求平均值。所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量分析

黑毛組6種石斛多糖含量見表2，多糖含量在0.59%～17.08%之間。其中含量最低的是長距石斛，僅有0.59 %，最高的是翅梗石斛，為17.08%，兩者相差將近三十倍；其次分別是美麗石斛、龍骨石斛、翅萼石斛、處子石斛，含量介于0.76%～4.8%之間；龍骨石斛和翅萼石斛多糖含量無顯著性差異(P> 0.005，下同)，其余各石斛多糖間差異顯著(P< 0.005，下同)。多糖是石斛的主要藥性成分之一，若以藥典規(guī)定鐵皮石斛多糖不得少于25%的標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評價，黑毛組6種石斛的品質(zhì)偏低，并非是研究石斛多糖的良好來源。

2.2 醇溶性浸出物含量分析

黑毛組6種石斛醇溶性浸出物含量見表2，含量在7.62%～13.54%之間。醇溶性浸出物含量由高至低依次是翅萼石斛、處子石斛、長距石斛、翅梗石斛、美麗石斛、龍骨石斛；醇溶性浸出物含量最高的翅萼石斛是含量最低的龍骨石斛的1.78倍；翅梗石斛和長距石斛醇溶性浸出物含量無顯著差異，其余各石斛醇溶性浸出物含量差異顯著。醇溶性浸出物是石斛的主要藥性成分之一，含量高低與藥理作用有密切的關(guān)聯(lián)，若以藥典規(guī)定鐵皮石斛醇溶性浸出物不得少于6.5%的標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評價，黑毛組石斛醇溶性浸出物含量豐富，可作為研究石斛醇溶性浸出物的良好材料。

2.3 石斛堿含量分析

黑毛組6種石斛石斛堿含量見表2，均未檢出。Luning[16]對548個蘭科植物的生物堿進(jìn)行測定，涵蓋了120個不同種質(zhì)石斛，其中翅梗石斛和長距石斛生物堿含量介于0.01%～0.10%；王再花等[17]采用酸性染料比色法比較研究了26種野生石斛和9個春石斛品種的生物堿含量，其中翅梗石斛生物堿含量均低于 0.01%。上述研究結(jié)果表明，部分黑毛組石斛中存在少量生物堿。石斛堿作為金釵石斛的特征成分，在所測的6種黑毛組石斛中均未檢出，可進(jìn)一步研究其中的微量生物堿。

表2 黑毛組6種石斛藥效成分含量

注：“-”，未檢出；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)。

Note:“-”,not detected;values with different small letter within the same line have significant difference(P< 0.05).

2.4 氨基酸含量分析

黑毛組6種石斛17種氨基酸組成及含量見表3，氨基酸總量介于3.45%～4.53%之間，含量由高至低依次是美麗石斛、翅萼石斛、長距石斛、處子石斛、翅梗石斛、龍骨石斛。6種石斛樣品中，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸3種氨基酸含量最高，蛋氨酸、半胱氨酸和組氨酸含量偏低。

所測的17種氨基酸中必需氨基酸7種(Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys)，非必需氨基酸10種(Cys、Tyr、Asp、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、His、Arg)，6種石斛樣品中必需氨基酸含量為1.22%～1.62%，非必需氨基酸含量為2.23%～2.97%。根據(jù)WHO和FAO提出的蛋白質(zhì)理想模式，即必需氨基酸占總氨基酸百分含量為40%，占非必需氨基酸百分含量為60%以上[15]，6種石斛中有3種石斛接近理想模式，分別是翅梗石斛、長距石斛和翅萼石斛，說明這3種石斛的蛋白質(zhì)是優(yōu)良的蛋白來源，有較大的開發(fā)潛力。6種石斛還具有豐富的藥用氨基酸(Asp、Glu、Gly、Arg、Met、Phe、Leu、Lys、Tyr)，含量為2.30%～3.06%。藥用氨基酸與總氨基酸含量比值為61.94%～69.11%，平均值為65.22%，由高至低依次是處子石斛、美麗石斛、龍骨石斛、翅萼石斛、長距石斛、翅萼石斛。石斛自古以來在我國為中藥材所用，分析其中的藥用氨基酸組成和含量，可為黑毛組石斛藥材質(zhì)量評價和將其開發(fā)為藥品保健品提供科學(xué)依據(jù)。

表3 黑毛組6種石斛氨基酸組成和含量(%)

注：T：氨基酸總量；a：必需氨基酸總量；b：非必需氨基酸總量；c：藥用氨基酸。

Note:T:total amino acid;a:total essential amino acids;b:total non-essential amino acids;c:amino acids for medical purposes.

2.5 氨基酸營養(yǎng)價值評價

2.5.1 必需氨基酸組成成分分析

半胱氨酸和酪氨酸在體內(nèi)可分別由蛋氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)變而成，如果膳食中能夠直接提供這兩種氨基酸，則人體對蛋氨酸和苯丙氨酸的需求相對減少，所以WHO/FAO 模式值將它們分別合并計算。6種石斛必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表4。由表4可知，6種石斛的必需氨基酸總含量在40.84%～46.46%之間，明顯高于 WHO/FAO 模式值35%，這表明黑毛組6種石斛蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量豐富，食用價值較高。從單個必需氨基酸的含量分析，黑毛組石斛中苯丙氨酸+酪氨酸的含量最高(9.11%～11.03%)，作為藥用氨基酸的組成成分，含量遠(yuǎn)高于WHO/FAO模式值。綜上，黑毛組6種石斛蛋白具有一定的藥用價值。

表4 黑毛組石斛必需氨基酸的組成成分及含量(%)

2.5.2 6種石斛必需氨基酸比值系數(shù)

必需氨基酸比值系數(shù)法是利用WHO/FAO的必需氨基酸模式，通過計算得到樣品中RAA、RC、SRC，根據(jù)計算結(jié)果對植物蛋白營養(yǎng)價值進(jìn)行直觀評價。RC值可評價單個氨基酸組成比例，F(xiàn)AO/WHO模式單個氨基酸RC值為1，作為參照指標(biāo)，樣品中單個氨基酸偏大表示含量相對過剩，偏小表示含量相對不足，其中含量最低的為該樣品第一限制氨基酸。由表5可知，美麗石斛的第一限制氨基酸為纈氨酸，RC值為0.83；龍骨石斛、處子石斛的第一限制氨基酸為亮氨酸，RC值分別為0.78、0.69；翅梗石斛、長距石斛、翅萼石斛3種國內(nèi)原生種的第一限制氨基酸均為賴氨酸，RC值分別為0.79、0.85、0.87。

SRC作為綜合評價指標(biāo)，其值越接近100，表示RC值越集中，各必需氨基酸含量均衡，其營養(yǎng)價值越高。6種石斛的SRC值介于52.42～83.74，其中翅萼石斛中必需氨基酸SRC值(83.74)最高，處子石斛中必需氨基酸SRC值(52.42)最低。除處子石斛外的5種石斛中，必需氨基酸SRC值均高于70，可提供優(yōu)質(zhì)植物蛋白。

表5 黑毛組石斛必需氨基酸的RAA、RC、SRC比較

續(xù)表5(Continued Tab.5)

種類Species參數(shù)Parameter氨基酸種類Sort of amino acid蘇氨酸Thr纈氨酸Val異亮氨酸Ile亮氨酸Leu賴氨酸Lys蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys苯丙氨酸+酪氨酸Phe+TyrSRCRC0.890.941.030.840.791.121.38長距石斛D. longicornuRAA0.050.050.060.050.050.060.0880.22RC0.890.901.030.860.851.071.40翅萼石斛D. cariniferumRAA0.050.050.060.050.050.050.0783.74RC0.920.921.010.920.871.001.35處子石斛D. virgineumRAA0.040.040.040.030.040.100.0652.42RC0.70 0.76 0.800.690.842.001.20

2.6 藥效成分及營養(yǎng)價值相關(guān)性評價

利用SPSS 20.0軟件對包括藥效成分及營養(yǎng)價值在內(nèi)的7個指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計描述和相關(guān)性分析，結(jié)果見表6、7。從變異系數(shù)(表6)來看，多糖變異系數(shù)值最大，達(dá)到137.24%；氨基酸總量變異系數(shù)最小，為9.18%；其余各指標(biāo)變異系數(shù)從高到低排列順序為：醇溶性浸出物>SRC值>藥用氨基酸>非必需氨基酸含量>必需氨基酸含量。由相關(guān)性分析可知(表7)，氨基酸總量與必需氨基酸含量呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)，氨基酸總量與非必需氨基酸、藥用氨基酸含量呈極顯著正相關(guān)(P< 0.01)，非必需氨基酸與藥用氨基酸之間呈極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明，氨基酸成分存在一定相關(guān)性，而與多糖、醇溶性浸出物及SRC相互之間均無顯著相關(guān)性。

表6 黑毛組石斛各指標(biāo)描述統(tǒng)計分析

表7 6種石斛各指標(biāo)相關(guān)性分析

注：“*”和“**”分別表示在0.05、0.01水平上顯著、極顯著相關(guān)。

Note:“*” and “**” indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level,respectively.

3 結(jié)論與討論

組培快繁技術(shù)的發(fā)展，為保護(hù)稀缺植物資源提供了解決途徑，同時促進(jìn)了商業(yè)化推廣[18]。我國石斛資源豐富，有81種，2個變種，具有較大的研究開發(fā)空間。黑毛組是石斛屬12個組群中比較特殊的分類群，對其進(jìn)行深入研究，有利于豐富石斛中藥來源，同時對開發(fā)選育優(yōu)良品種石斛和保護(hù)藥用石斛種質(zhì)資源具有重要意義。

石斛多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、降血糖等功效，是石斛中重要的功能活性物質(zhì)[19]；醇溶性浸出物是石斛的主要藥效成分，包含黃酮類、多酚類、菲類、芪類和倍半萜等多種有效物質(zhì)，具有優(yōu)良的抗氧化性、抗腫瘤及耐藥性等功效[20]；石斛堿是金釵石斛中主要的生物堿類，具有解熱、鎮(zhèn)痛等功效，具有較高的研究開發(fā)價值，目前在其它石斛中未發(fā)現(xiàn)大量存在[21]。不同種質(zhì)石斛的藥效成分及生物活性存在一定的相似性[2]，本研究以藥典規(guī)定的鐵皮石斛多糖、醇溶性浸出物及金釵石斛石斛堿含量為標(biāo)準(zhǔn)，對黑毛組6種石斛基本藥效成分進(jìn)行初步分析評價。結(jié)果表明，黑毛組6種石斛中多糖含量普遍偏低，介于0.59%～17.08%，含量最高的翅梗石斛與含量最低的長距石斛相差28.95倍，均低于藥典規(guī)定鐵皮石斛多糖不得少于25%的標(biāo)準(zhǔn)，若從多糖含量方面考慮，研究意義不大，可從生物活性角度對其進(jìn)行研究。6種石斛中醇溶性浸出物含量介于7.62%～13.54%，均高于藥典規(guī)定鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)6.5%，含量最高的翅萼石斛為標(biāo)準(zhǔn)的兩倍，作為石斛的主要藥性成分，黑毛組石斛較高含量的醇溶性浸出物為具體分析某一藥效成分奠定了基礎(chǔ)。6種黑毛組石斛樣品中均未檢出石斛堿，而相關(guān)文獻(xiàn)中提到翅梗石斛和長距石斛含有微量生物堿[16,17]，后續(xù)研究將對其他生物堿進(jìn)行分析鑒定。

石斛作為一種“藥食兩用”的植物，蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸作為蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物是評價其營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)[4]。氨基酸分析結(jié)果表明：黑毛組6種石斛均含有色氨酸以外的17種氨基酸，總量介于3.45%～4.53%之間，其中翅梗石斛、長距石斛和翅萼石斛接近WHO/FAO提出的理想模式(a/T = 40%，b/T = 60%)。6種石斛17種氨基酸中，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸3種氨基酸含量最高，三者均是藥用氨基酸組成成分。6種石斛的藥用氨基酸與總氨基酸含量比值為61.94%～69.11%。必需氨基酸組成占氨基酸總量的40.84%～46.46%，較WHO/FAO模式值(35%)高；單個氨基酸含量中苯丙氨酸+酪氨酸的含量最高(9.11%～11.03%)，優(yōu)于WHO/FAO模式值(6%)。6種石斛的SRC值介于52.42～83.74，除處子石斛外SRC值均高于70，接近或高于紫花苜蓿SRC值[22]，可作為優(yōu)質(zhì)植物蛋白來源。

藥用植物有效成分含量與藥效之間具有一定關(guān)聯(lián)性。6種黑毛組石斛中，緬甸原生種與國內(nèi)原生種藥效成分及營養(yǎng)成分含量之間存在一定差異，表明其藥效不盡相同，對不同種質(zhì)應(yīng)分別進(jìn)行研究和開發(fā)。6種石斛中多糖變異系數(shù)最大(137.24%)，其次為醇溶性浸出物(18.95%)。石斛樣品均來自同一資源圃，避免了不同生長環(huán)境的影響，藥效成分差異較大的原因主要是由于種質(zhì)基因的不同，這與其他種質(zhì)石斛的研究結(jié)果一致[23]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，營養(yǎng)成分之間存在一定相關(guān)性，而藥效成分與營養(yǎng)成分及藥效成分之間無顯著相關(guān)性。組(Section)作為非正式分類階元，僅從外觀形態(tài)對黑毛組進(jìn)行分類存在一定局限性，其分類、分組方法有待進(jìn)一步研究。

本研究補(bǔ)充了石斛屬植物藥效成分方面的數(shù)據(jù)，為藥用石斛的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。由于樣品較少及收集困難等原因，本研究未分析測定黑毛石斛組其它種質(zhì)石斛的藥效成分，有望在后續(xù)工作中逐步開展。