華中五味子中一個(gè)新的糖苷類(lèi)化合物及活性研究

季嘉誠(chéng)，邱 峰，雷新響

中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430074

華中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬(Schisandra)植物，主要產(chǎn)于湖北、湖南、四川、貴州、云南東北部等地區(qū)，生于海拔600-3000米的濕潤(rùn)山坡邊或灌叢中[1]。根據(jù)現(xiàn)代研究表明，華中五味子具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜、PAF拮抗、延緩衰老、清除自由基、抑制過(guò)氧化脂質(zhì)形成、抗炎、抗HIV等藥理作用[2]。其中，任榮從華中五味子中分離得到的methylgomisin O和schisantherin A具有抗炎活性作用[3]；Gao等[4]人從華中五味子中分離得到的anwulignan具有較好的肝保護(hù)作用；Liu等[5]從華中五味子中分離得到的schisphenthin A等三萜類(lèi)化合物具有抗增殖作用，分離得到的schisphenlignan L等木脂素類(lèi)化合物具有神經(jīng)保護(hù)作用。

因此，華中五味子中仍具有待發(fā)現(xiàn)、活性較好的成分。鑒于華中五味子果實(shí)的研究較多，本實(shí)驗(yàn)選取華中五味子藤莖，對(duì)其化學(xué)成分和活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。從中分離了得到7個(gè)化合物，通過(guò)波譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別為：6′′-O-對(duì)羥基苯甲酰紅景天苷(1)、nectandrin B(2)、7-(3,4-dimethoxyphenyl)-7′(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-8,8′(dimethylbutyl) acetate(3)、henricine B(4)、(8R,8′R)-3,4-dimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-dioxo-8,8′-neolignan(5)、secoisolariciresinol(6)、calceolarioside B(7)?；衔?為新化合物，化合物1、6、7具有較好的NO釋放的抑制作用。

1 儀器與材料

Bruker AM-600型核磁共振光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Agilent 1260Ⅱ型HPLC(Agilent公司)，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×250 mm)，粒徑5 μm；半制備柱Venusil XBP C18柱(10×250 mm)，粒徑5 μm；TBP-5010型中壓柱(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠(chǎng))；薄層硅膠板(青島海洋化工廠(chǎng))；95%乙醇(武漢興和達(dá)商貿(mào)有限公司)；反相硅膠 Chromatores(日本Fuji公司)；石油醚(化學(xué)純，上海泰坦化學(xué)有限公司)；乙酸乙酯(化學(xué)純，上海泰坦化學(xué)有限公司)；甲醇(化學(xué)純，上海泰坦化學(xué)有限公司)；色譜甲醇(SIGMA公司)；色譜乙腈(成都科隆化學(xué)品有限公司)。

小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7， 購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；吲哚美辛(阿拉丁公司)；NO檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；LPS(上海源葉生物科技有限公司)。

華中五味子由中南民族大學(xué)藥學(xué)院楊光忠教授鑒定為華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的藤莖。

2 提取與分離

將華中五味子藤莖曬干，粉碎后稱(chēng)重，得10 kg。隨后用25升95%乙醇在室溫下滲漉提取3次，每次4天。將提取液進(jìn)行抽濾，除去藥渣，在進(jìn)行濃縮，得浸膏。浸膏用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取三次。將萃取液減壓濃縮后得乙酸乙酯部位168 g。用300 g正相柱硅膠(200～300目)拌樣，3 000 g正相柱硅膠(200～300目)濕法裝柱，采用干法上樣，進(jìn)行柱層析。用石油醚-乙酸乙酯體系(體積比15∶1→0∶1)進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC檢測(cè)后的色譜行為相似性，得6個(gè)組段，編號(hào)為Fr.A～F。將Fr.B用反相硅膠柱層析分離，得8個(gè)組分：Fr.B-1～B-8。將Fr.C用反相硅膠柱層析分離，得4個(gè)組分：Fr.C-1～C-4。取Fr.C-2(39.0 mg)進(jìn)行半制備型HPLC純化(甲醇：水=55∶45，3 mL/min)，得化合物5(2.0 mg，tR=6.9 min)。取Fr.C-3(123.6 mg)進(jìn)行半制備型HPLC純化(甲醇∶水=60∶40，3 mL/min)，得化合物2(7.7 mg，tR=33.0 min)和化合物3(3.2 mg，tR=40.8 min)。將Fr.D用反相硅膠柱層析分離，得10個(gè)組分：Fr.D-1～D-10。取Fr.D-5(113.8 mg)進(jìn)行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=40∶

60，3 mL/min)，得化合物4(14.4 mg，tR=33.0 min)。將Fr.F用反相硅膠柱層析分離，得11個(gè)組分：F-1～F-11。取Fr.F-5(204.9 mg)進(jìn)行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=15∶85，3 mL/min)，得化合物1(2.1 mg，tR=23.3 min)。取Fr.F-7(137.6 mg)進(jìn)行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=19∶81，3 mL/min)，得化合物7(9.6 mg，tR=18.5 min)。取Fr.F-8(151.8 mg)進(jìn)行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=23.5∶76.5，3 mL/min)，得化合物6(7.5 mg，tR=18.7 min)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末狀物質(zhì)， -50°(c0.02，MeOH)，HR-ESI-MS譜給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z443.131 1[M + Na]+(計(jì)算：443.131 8)，故確定分子式為C21H24O9，不飽和度為10。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of compound 1

表1 化合物1的1H和13C譜數(shù)據(jù)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

PositionδH(J in Hz)δC3.90,m1''4.31,d,7.8104.62''3.22,m75.13''3.39,m784''3.39,m725''3.58,m75.56''4.41,dd,11.8,6.364.94.59,dd,11.8,2.1

化合物1的1H NMR譜和13C NMR譜(Table 1)中顯示兩個(gè)典型的苯環(huán)對(duì)位雙取代系統(tǒng)[δH6.66(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.98(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，7.85(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)]，一個(gè)葡萄糖信號(hào)[ 4.31(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′′)，3.22(1H，m，H-2′′)，3.39(1H，m，H-3′′)，3.39(1H，m，H-4′′)，3.58(1H，m，H-5′′)，4.41(1H，dd，J=6.3，11.8 Hz，H-6a′′)，4.59(1H，dd，J=2.1，11.8 Hz，H-6b′′)]，一個(gè)亞甲基信號(hào)[2.81(2H，m，H-7′)]，一個(gè)含氧亞甲基信號(hào)[3.70，3.91(2H，m，H-8′)]和一個(gè)酯基信號(hào)(δC168.05)。因此，基本可以推出該化合物的平面結(jié)構(gòu)。此化合物1的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可以從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

在HMBC譜可以看出(圖2)，H-3′(δH6.98)與C-7′(δC36.54)存在相關(guān)，H-8′(δH3.70，3.91)與C-7′(δC36.54)存在相關(guān)，H-1′′(δH4.31)與C-8′(δC72.44)存在相關(guān)，H-2(δH7.85)與C-7(δC168.05)存在相關(guān)以及H-6′′(δH4.41，4.60)與C-7(δC168.05)存在相關(guān)，可以推出乙氧基連在C-4′(δC130.57)上，葡萄糖連的位置在C-8′上，對(duì)羥基苯甲酸通過(guò)酯化反應(yīng)連在糖的6′′位上。因此，可以確認(rèn)化合物1的平面結(jié)構(gòu)，如圖1所示。

由于葡萄糖的端基氫的耦合常數(shù)為7.8 Hz，因此可以推出糖苷鍵為β構(gòu)型，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，可以發(fā)現(xiàn)化合物1與6′′-O-galloyl salidroside[6]非常相似，它們之間差別就是化合物1少了3、5位的羥基。通過(guò)文獻(xiàn)查閱還可以發(fā)現(xiàn)化合物1應(yīng)該是紅景天苷[7]跟對(duì)羥基苯甲酸酯化形成，故推斷出化合物1的葡萄糖為β-D型。因此，化合物1為6′′-O-對(duì)羥基苯甲酰紅景天苷。

圖2 化合物1的關(guān)鍵HMBC相關(guān)Fig.2 The key HMBC correlations of compound 1

化合物2黃色油狀;1H NMR(CDCl3，600MHz)δH：1.03(6H，d，J=6.6 Hz，3-Me，4-Me)，2.32(2H，m，H-3，H-4)，3.88(6H，s，3′-OMe，3′′-OMe)，4.49(2H，d，J=6.6 Hz，H-2，H-5)，5.62(2H，s，4′-OH，4′′-OH)，6.91(2H，s，H-2′，H-2′′)，6.92(2H，d，J=1.7 Hz，H-5′，H-5′′)，6.95(2H，d，J=1.7 Hz，H-6′，H-6′′)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δC：13.0(3-Me，4-Me)，44.3(C-3，C-4)，55.9(3′-OMe，3′′-OMe)，87.3(C-2，C-5)，109.1(C-2′，C-2′′)，114.1(C-5′，C-5′′)，119.3(C-6′，C-6′′)，134.2(C-1′，C-1′′)，145.0(C-4′，C-4′′)，146.4(C-3′，C-3′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為nectandrin B。

化合物3微黃油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：0.78(3H，d，J=6.8 Hz，H-9′)，1.02(3H，d，J=6.8 Hz，H-9)，1.79(1H，m，H-8)，2.03(3H，s，H-11)，2.42(1H，m，H-8′)，3.68(1H，d，J=11.2 Hz，H-7′)，3.80(3H，s，4-OMe)，3.82(1H，overlap，H-7)，3.82(3H，s，3-OMe)，3.85(3H，s，3′-OMe)，4.16(1H，dd，J=10.8，4.8 Hz，H-7)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.81(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，6.90(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.91(1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6)，6.92(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：13.5(C-9′)，17.1(C-9)，21.0(C-11)，34.4(C-8)，40.3(C-8′)，56.5(C-7′)，56.5(3′-OMe)，56.5(3-OMe)，57.3(4-OMe)，67.2(C-7)，112.8(C-2′)，112.8(C-2)，113.0(C-5′)，116.3(C-5)，121.2(C-6′)，121.2(C-6)，137.6(C-1′)，139.7(C-1)，145.6(C-4′)，148.6(C-4)，148.9(C-3′)，150.2(C-3)，173.3(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為7-(3,4-dimethoxyphenyl)-7′(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-8,8′(dimethylbutyl)acetate。

化合物4白色粉末;1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：0.75(3H，d，J=7.0 Hz，H-9′)，0.98(3H，d，J=7.0 Hz，H-9)，1.89(1H，m，H-8)，2.02(3H，s，H-11)，2.36(1H，m，H-8′)，3.62(1H，d，J=11.73 Hz，H-7′)，3.80(1H，d，J=11.2 Hz，H-7)，3.82(3H，brs，H-12)，3.82(3H，brs，H-13)，4.12(1H，dd，J=10.9，5.1 Hz，H-7)，6.71(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.76(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′)，6.78(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，6.87(1H，d，J=1.6 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：13.5(C-9′)，17.1(C-9)，21.0(C-11)，34.3(C-8)，41.9(C-8′)，56.5(C-12)，56.5(C-13)，57.2(C-7′)，67.4(C-7)，112.6(C-2′)，112.8(C-2)，116.1(C-5′)，116.3(C-5)，121.1(C-6′)，121.2(C-6)，138.0(C-1′)，138.4(C-1)，145.3(C-4′)，145.3(C-4)，148.8(C-3′)，148.8(C-3)，173.8(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為henricine B。

化合物5微黃油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：2.14(3H，brs，H-9)，2.15(3H，brs，H-9′)，3.78(3H，s，3′-OMe)，3.87(1H，m，H-8′)，3.89(3H，s，4′-OMe)，3.95(1H，d，J=14.8 Hz，H-8)，6.02(2H，s，OCH2O)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.92(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，7.05(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.23(1H，dd，J=8.2，1.6 Hz，H-6′)，7.28(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：15.9(C-9′)，16.0(C-9)，48.2(C-8′)，48.4(C-8)，54.9(3′-OMe)，55.1(4′-OMe)，102.1(OCH2O)，107.2(C-5′)，107.6(C-5)，109.9(C-2′)，110.7(C-2)，124.8(C-6)，126.4(C-6′)，129.7(C-1)，131.5(C-1′)， 148.1(C-3′)，148.9(C-3)，152.2(C-4′)，153.8(C-4)，197.8(C-7′)，198.3(C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為(8R,8′R)-3,4-Dimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-dioxo-8,8′-neolignan。

化合物6紅色油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：1.90(2H，m，H-8，H-8′)，2.57(2H，m，H-7a，H-7a′)，2.64(2H，m，H-7b，H-7b′)，3.58(4H，m，H-9，H-9′)，3.73(6H，s，3-OMe，3′-OMe)，6.53(2H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6，H-6′)，6.58(2H，d，J=1.8 Hz，H-2，H-2′)，6.65(2H，d，J=8.0 Hz，H-5，H-5′)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：34.6(C-7，C-7′)，42.6(C-8，C-8′)，54.7(3-OMe，3′-OMe)，60.7(C-9，C-9′)，111.6(C-2，C-2′)，114.3(C-5，C-5′)，121.3(C-6，C-6′)，132.4(C-1，C-1′)，144.0(C-4，C-4′)，147.4(C-3，C-3′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為secoisolariciresinol。

化合物7褐色油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：2.80(2H，m，H-β′)，3.23(1H，t，J=8.2 Hz，H-2′)，3.39(2H，m，H-3′，H-4′)，3.54(1H，m，H-5′)，3.72(1H，dd，J=16.9，8.1 Hz，H-α)，3.97(1H，dd，J=16.7，8.0 Hz，H-α)，4.34(2H，m，H-1′，H-6′)，4.51(1H，dd，J=11.8，1.8 Hz，H-6′)，6.30(1H，d，J=15.8 Hz，H-α′′)，6.55(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6)，6.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.69(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′′)，6.90(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6′′)，7.05(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′′)，7.58(1H，dd，J=15.8，2.0 Hz，H-β′′)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：35.3(C-β)，63.2(C-6′)，70.3(C-4′)，71.0(C-α)，73.6(C-2′)，74.0(C-5′)，76.5(C-3′)，103.1(C-1′)，113.4(C-α′′)，113.6(C-2′′)，114.9(C-5)，115.1(C-5′′)，115.7(C-2)，119.8(C-6)，121.8(C-6′′)，126.2(C-1′′)，129.9(C-1)，143.2(C-4)，144.7(C-3)，145.4(C-β′′)，145.9(C-3′′)，148.2(C-4′′)，167.8(C=O)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為calceolarioside B。

4 化合物抗炎活性研究

細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[14]的操作步驟，在CO2濃度為5%，溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)含有RAW 264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基，隔天傳代，備用。衡量NO水平的指標(biāo)為Griess法測(cè)定樣品中的NO2-/NO3-。取RAW 264.7單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL /孔)中，細(xì)胞數(shù)為1×104/孔。在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，將100 μL 陽(yáng)性藥(吲哚美辛)或受試化合物溶液加入到每個(gè)孔中，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在30 min后每孔加入100 μl的LPS(終濃度5 μg/mL)。然后置于37 ℃培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)液上清50 μL加入到酶標(biāo)板中，加入50 μL Griess I試劑，再加入50 μL Griess II試劑，540 nm處測(cè)定吸光值。抑制率I的計(jì)算公式為:

化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制率見(jiàn)表2，可以看出吲哚美辛的抑制率為49.43%，化合物1、6、7的抑制率均比吲哚美辛的抑制率高，由此說(shuō)明化合物1、6、7具有較好的NO釋放的抑制作用。這為今后探尋華中五味子抗炎活性成分提供了一些科學(xué)依據(jù)。

表2 化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制率

5 討論

目前，對(duì)于華中五味子的研究主要為果實(shí)，關(guān)于其藤莖的化學(xué)成分研究報(bào)道較少[15]。本實(shí)驗(yàn)從華中五味子藤莖的95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位分離、鑒定了7個(gè)化合物，化合物1為糖苷類(lèi)化合物，化合物2～7均為木脂素類(lèi)化合物，且化合物1為新化合物。此外對(duì)這些化合物進(jìn)行了抗炎活性研究，研究表明化合物1、6、7在50 μmol/L的濃度下，對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO生成抑制率均比吲哚美辛的抑制率高，說(shuō)明化合物1、6、7具有較好的NO釋放的抑制作用，這對(duì)木脂素類(lèi)和糖苷類(lèi)化合物的生物活性研究具有一定的價(jià)值和意義。炎癥是人類(lèi)疾病中最常見(jiàn)的病理過(guò)程，大多數(shù)疾病均與此有關(guān)[16]。根據(jù)華中五味子的應(yīng)用和價(jià)值，其抗炎活性及其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。本研究不僅豐富了華中五味子的化學(xué)成分及藥理活性研究，還為其木脂素成分、糖苷類(lèi)成分的抗炎活性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并對(duì)華中五味子進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與利用提供了理論基礎(chǔ)。