基于生物分子網(wǎng)絡(luò)和分子對接研究槲皮素抗宮頸癌的機制

朱曉芹，劉志強，王博龍*

1宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，宜春 336000；2鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鶴壁 458000

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，高居女性惡性腫瘤的第2位，是一種嚴(yán)重危害女性健康的疾病。臨床上早期宮頸癌治療以手術(shù)為主，但宮頸癌起病隱匿，不同地區(qū)的篩查手段及技術(shù)差異使得半數(shù)以上的患者就診時已處于中晚期[1,2]。中晚期宮頸癌治療以放化療為主，手術(shù)為輔，然而宮頸癌是對放射線中等敏感的實體腫瘤，對于年輕女性患者，放療還會損傷卵巢，導(dǎo)致卵巢早衰等一系列并發(fā)癥?；熕幬锊粌H毒副作用大，而且部分毒副作用跟放療副作用重疊，一般患者難以耐受。因此，仍需努力尋找高效低毒的抗宮頸癌藥物。

槲皮素(quercetin)是一種廣泛分布于蔬菜、水果及多種中草藥的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗菌及清除自由基等藥理作用。大量流行病學(xué)證據(jù)表明，多食富含槲皮素的水果和蔬菜可以預(yù)防多種癌癥的發(fā)生[3]，而槲皮素本身抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的顯著作用，也在多種癌株的體內(nèi)外實驗中得到證實。近年來，槲皮素在宮頸癌放化療上的雙重作用引起了越來越多的關(guān)注，但具體機制尚未完全明確。本研究借助生物分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)整合的大量生物信息及數(shù)據(jù)，挖掘槲皮素抗宮頸癌靶點，進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，篩選主要靶點與槲皮素進(jìn)行分子對接，以期全面解析槲皮素抗宮頸癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

(1)活性成分靶點數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺，TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/ tcmsp.php)；Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetsprediction.ch/)；毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫CTD(http://ctdbase.org/)。(2)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，UniProt(https://www.uniprot.org/)；PDB(http://www.rcsb.org/)。(3)疾病靶點數(shù)據(jù)庫：GeneCards(https://www.genecards.org/)；DisGeNET(http://www.disgenet.org/)；Open Targets Platform(https://www.targetsvalidation.org)。(4)蛋白質(zhì)相互作用分析平臺，STRING(https://string-db.org/)。(5)生信在線分析平臺：OmicShare云平臺(http://omicshare.com/)；DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)。(6)網(wǎng)絡(luò)分析及作圖軟件Cytoscape 3.6.1；Venny 2.1.0(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html)；ChemBioOffice 2014。(7)分子對接相關(guān)軟件：分子三維結(jié)構(gòu)處理軟件PyMOL；AutoDuck Vina[4]及AutoDuck Tools。

1.2 槲皮素抗宮頸癌靶點篩選及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將槲皮素輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索其作用靶點；運用Swiss TargetPrediction服務(wù)器的藥效團(tuán)模型和基于配體分子相似性，預(yù)測槲皮素作用靶點；在CTD數(shù)據(jù)庫中選取槲皮素匹配度高的前200個靶點，將以上三個來源的靶點合并去重后得到槲皮素作用靶點。分別在GeneCards、DisGeNET、Open Targets數(shù)據(jù)庫中檢索宮頸癌相關(guān)靶點，將每個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點按照相關(guān)度打分，從高到低選取分值前200個靶點，合并去重后得到宮頸癌靶點。再將宮頸癌靶點與槲皮素靶點輸入Venny 2.1.0軟件，取交集部分作為槲皮素抗宮頸癌靶點，并導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建槲皮素-抗宮頸癌靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 槲皮素抗宮頸癌靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將槲皮素抗宮頸癌靶點導(dǎo)入STRING平臺構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence=0.4”，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。將 PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，利用“Network Analysis”功能計算各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的度值(Degree)、介數(shù)(Betweenness)及最短路徑(Closeness)等拓?fù)鋮?shù)，節(jié)點的Degree、Betweenness、Closeness越大，該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的位置就越重要。選取Degree、Betweenness、Closeness同時在平均值之上的靶點作為槲皮素抗宮頸癌的主要靶點。

1.4 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將槲皮素抗宮頸癌靶點輸入OmicShare和DAVID 6.8平臺，分別進(jìn)行槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，依據(jù)P-value<0.001和P-value<0.05篩選槲皮素抗宮頸癌靶點富集的生物功能及信號通路。

1.5 槲皮素抗宮頸癌主要靶點的分子對接

在PDB數(shù)據(jù)庫搜索槲皮素抗宮頸癌前十個主要靶點的蛋白晶體復(fù)合物，借助PyMOL軟件將靶蛋白與原配體分離，同時去除靶蛋白中的水分子、磷酸根以及多余的非活性配體，在AutoDuck Tools軟件中對處理后靶蛋白進(jìn)行加氫、加電荷等操作。將槲皮素的2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemBio3D軟件，以mol2的格式保存其3D結(jié)構(gòu)，將靶蛋白、原配體、槲皮素的3D結(jié)構(gòu)統(tǒng)一設(shè)置成AutoDuck Tools軟件可識別的pdbqt格式，以原配體所在位點為靶蛋白的活性口袋，分別進(jìn)行靶蛋白與槲皮素、原配體的分子對接，對比分析原配體、槲皮素與各靶蛋白的親和力。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抗宮頸癌靶點及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別從TCMSP、Swiss TargetPrediction、CTD數(shù)據(jù)庫篩得靶點96、100、200個，合并去重后確定槲皮素靶點為311個；分別從GeneCards、DisGeNET、Open Targets 三個數(shù)據(jù)庫各取前200個靶點，合并去重后確定宮頸癌靶點為460個，再將311個成分靶點與460個疾病靶點取交集，得到槲皮素抗宮頸癌靶點97個(圖1)。將槲皮素及97個抗宮頸癌靶點導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.1 軟件，得到槲皮素-抗宮頸癌靶點網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

圖1 槲皮素-抗宮頸癌靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of quercetin-anticervical cancer targets

2.2 槲皮素抗宮頸癌靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

如圖3所示，每個參與互作的靶點用一個圓圈表示，圓圈面積越大表示其Degree越大，圓圈周線越粗代表其Betweenness越大。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有97個節(jié)點，2 311條相互作用連線，平均Degree為47.65，平均Betweenness為5.31×10-3，平均Closeness為6.80×10-1，Degree、Betweenness、Closeness同時在平均值之上的靶點有29個(表1)。29個主要靶點包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄及凋亡TP53、MYC、AKT1、CASP3、CASP8、CTNNB1、CYCS、EP300、ERBB2、MAPK1、MAPK3、SRC、STAT3；調(diào)控炎癥反應(yīng)IL6、TNF、PTGS2、IL1B、CXCL8 ；參與血管生成EGF、EGFR、VEGFA；調(diào)控細(xì)胞周期CCND1、CDKN2A、PTEN ；以及性激素受體AR、ESR1和其它。

圖2 槲皮素-抗宮頸癌靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The network of quercetin-anticervical cancer targets注：箭頭表示槲皮素，三角形表示宮頸癌靶點。Note:The arrow represents quercetin and the triangle represents the targets of cervical cancer.

表1 主要靶點及其拓?fù)鋮?shù)

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The network of protein-protein interaction

2.3 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集

依據(jù)P-value<0.001篩選出GO條目525個，其中生物過程(Biology Process)473個，分子功能(Molecular Function)30個，細(xì)胞組成(Cellular Componet)22個。如圖4所示，生物過程主要涉及刺激反應(yīng)、生物過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、生物粘附等；分子功能及細(xì)胞組成主要涉及抗氧化活性、催化活性、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等。進(jìn)一步富集發(fā)現(xiàn)GO條目主要聚集在細(xì)胞增殖、凋亡、死亡、代謝等方面(圖5)，說明槲皮素可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等發(fā)揮抗宮頸癌作用。

2.4 槲皮素抗宮頸癌靶點的KEGG通路

依據(jù)P-value<0.05篩得槲皮素抗宮頸癌靶點KEGG通路22條(表2)，圖6為各通路富集氣泡圖，富集因子(Rich factor)是槲皮素富集在通路下的靶點與該通路所有蛋白的比值，比值越大表示富集度越大。P-value取值范圍[0，1]，顏色越紅表示P-value越小，富集越明顯。點的大小表示槲皮素富集在通路下的靶點個數(shù)，點越大表示富集靶點越多。由圖可知，富集因子較大的通路包括與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的p53信號通路、FoxO信號通路、Apoptosis通路、TNF信號通路、mTOR信號通路；與腫瘤血管新生及微環(huán)境形成相關(guān)的HIF-1信號通路、VEGF信號通路。其中癌癥通路富集的靶點最多，p53信號通路的富集因子最大。如圖7所示，p53信號通路上富集的槲皮素抗宮頸癌靶點有細(xì)胞周期相關(guān)的p21、CyclinD、CyclinB、CDK2、Cdc2；細(xì)胞凋亡相關(guān)的Fas、Bax、CASP3、CASP8、CASP9、CytC、IGF及IGF-BP3等，說明它們與槲皮素調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用密切相關(guān)。

2.5 槲皮素抗宮頸癌主要靶蛋白的分子對接

由表3可知，除4KZN靶蛋白外，其余9個靶蛋白與槲皮素結(jié)合能均<-5 kcal/mol，其中Myc原癌基因蛋白(圖8)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(圖9)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(圖10)與槲皮素的結(jié)合能最低，分別為-8.2、-7.9、-7.9 kcal/mol，說明上述靶蛋白與槲皮素親和力最高，它們與槲皮素相互作用的氨基酸殘基如表4所示。

圖4 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能分析Fig.4 Analysis of GO function of quercetin-anticervical cancer targets

圖5 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集Fig.5 GO enrichment of quercetin-anticervical cancer targets

表2 KEGG信號通路信息

圖6 槲皮素抗宮頸癌靶點的通路富集Fig.6 Pathways enrichment of quercetin-anticervical cancer targets

圖7 p53信號通路分析Fig.7 The analysis of p53 signaling pathway注：★代表槲皮素在p53通路的靶點。Note :★represents targets of quercetin of enrichment in the p53 pathway.

3 討論

天然產(chǎn)物是抗癌藥物發(fā)掘的重要源泉，紫杉醇、長春堿、喜樹堿、高三尖杉酯堿及人參皂苷Rg3等植物源性小分子已廣泛應(yīng)用于癌癥臨床治療[5]。槲皮素是自然界廣泛分布的天然黃酮類物質(zhì)，多項研究[6,7]表明其抗癌活性明顯，國外I和II期臨床試驗證實槲皮素能夠抑制多種腫瘤進(jìn)展[8]。國內(nèi)研究主要集中在槲皮素抗宮頸癌方面，如Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)槲皮素可上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞C33A凋亡，下調(diào)cyclin D1的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa、C33A的活力和增殖。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過上調(diào)Caspase-3，下調(diào)中期因子(Midkine，MK)的表達(dá)，顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。上述研究大多側(cè)重于細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的個別蛋白，不足以系統(tǒng)揭示槲皮素抗宮頸癌的復(fù)雜機制。

表3 槲皮素與主要靶蛋白的分子對接

表4 靶蛋白氨基酸殘基

圖8 Myc原癌基因蛋白的分子對接模型Fig.8 The docking model of Myc proto-oncogene protein

圖9 RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的分子對接模型Fig.9 The docking model of RAC-alpha serine/threonine-protein kinase

圖10 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3的分子對接模型Fig.10 The docking model of signal transducer and activator of transcription 3

本研究檢索多個化合物靶點數(shù)據(jù)庫、疾病靶點數(shù)據(jù)庫，挖掘出97個槲皮素抗宮頸癌靶點。借助蛋白互作篩出29個主要靶點，按照其功能可分為調(diào)控轉(zhuǎn)錄及凋亡的TP53、MYC、AKT1、CASP3、CASP8、CTNNB1、CYCS、EP300、ERBB2、MAPK1、MAPK3、SRC、STAT3；調(diào)控細(xì)胞周期CCND1、CDKN2A、PTEN ；參與血管生成的EGF、EGFR、VEGFA；調(diào)控炎癥反應(yīng)的IL6、TNF、PTGS2、IL1B、CXCL8 ；以及性激素受體AR、ESR1等，說明槲皮素抗宮頸癌機制除了誘導(dǎo)凋亡、阻滯周期外，還包括抗血管生成、調(diào)控炎癥等其它機制。選取主要靶點中的前十個與槲皮素進(jìn)行分子對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與MYC、STAT3及AKT1三個靶點的親和力最高。MYC屬于編碼核蛋白的癌基因，其家族基因及產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞增殖，永生化，去分化以及轉(zhuǎn)化等，在多種腫瘤形成過程中處于重要地位。Cui等[11]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)C-Myc可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞死亡，另有研究[12]證實槲皮素能抑制MYC基因結(jié)合位點的活性，阻止Myc向染色質(zhì)穩(wěn)定募集，使其不能促進(jìn)多能干細(xì)胞形成以及驅(qū)動腫瘤發(fā)生。STAT3被認(rèn)為在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，靶向STAT3被認(rèn)為是一種干預(yù)治療途徑，Chen等[13]實驗證實槲皮素不僅從基因轉(zhuǎn)錄方面抑制STAT3 mRNA的表達(dá),而且還能抑制Stat3蛋白激酶的活化，從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的AKT1可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期運行及細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，Liu等[14]發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2抑制劑通過下調(diào)AKT1蛋白表達(dá)而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。但尚未見到槲皮素可否通過AKT1作用于宮頸癌的相關(guān)報道，本文分子對接為進(jìn)一步探尋槲皮素抗宮頸癌機制提供了線索。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)槲皮素靶點主要富集在p53信號通路、Apoptosis通路、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT 信號通路等。其中富集因子最大的p53信號通路作用廣泛，涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移抑制、DNA的修復(fù)及損傷防御等，Vidya等[15]證實槲皮素通過p53依賴機制，誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞G2/M期阻滯及線粒體凋亡，以劑量依賴的方式抑制HeLa細(xì)胞存活。Xiang等[16]發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)Pi3k、p-Akt及Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，通過PI3K-Akt信號通路誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。Luo等[17]發(fā)現(xiàn)槲皮素納米顆粒通過抑制JAK2誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡和自噬，抑制STAT3/5和PI3K/Akt信號通路，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1和mTOR，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是一個高度復(fù)雜的綜合動態(tài)系統(tǒng)，由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，具有低氧、營養(yǎng)缺乏、酸中毒、慢性炎癥、免疫抑制，以及多種細(xì)胞因子產(chǎn)生等生物學(xué)特征，在抗癌藥物耐藥以及腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia- inducible factors，HIFs)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)等共同參與了腫瘤微環(huán)境形成及腫瘤血管生成。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素靶點還能顯著富集在的HIF-1信號通路和VEGF信號通路上，實驗[18]證實槲皮素可以靶向VEGFR-2，調(diào)控AKT/mTOR等下游信號通路，抑制腫瘤生長和血管形成。Hu等[19]則發(fā)現(xiàn)磷酸槲皮素可顯著抑制活化成纖維細(xì)胞中wnt16的表達(dá)，誘導(dǎo)TME重構(gòu)，發(fā)揮協(xié)同抗癌作用。

總之，本研究借助生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)與方法，系統(tǒng)研究了槲皮素抗宮頸癌靶點、生物過程、信號通路等，全面揭示了槲皮素多靶點、多通路、多機制抗宮頸癌的藥理學(xué)作用。