鬼燈擎中巖白菜素超聲提取純化工藝的優(yōu)化

雷燕妮,張小斌,李多偉，甘全明

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院,陜西 商洛 726000；3.西北大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710069;4.陜西富士金醫(yī)藥保健品有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075)

鬼燈檠又名七葉鬼燈檠，別名老蛇盤、秤桿七等，其是一種草本植物，屬虎耳草科，本品在我國(guó)秦巴山區(qū)廣泛分布，為民間常用草藥，其根莖是更為常用的藥材部分，主要功效為清熱解毒，除此之外還能止瀉、止血等。對(duì)菌痢、子宮脫垂、老年慢性支氣管炎等疾病都有較好的療效[1～3]。最近幾年，對(duì)其的研究更進(jìn)一步，普遍發(fā)現(xiàn)其含有的巖白菜素(Bergenin)是關(guān)鍵成分，這也是其能夠發(fā)揮抑菌和抗病毒的主要原因，而且在鬼燈檠中含量較高。筆者通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，篩選出一個(gè)更加優(yōu)化、甚至最優(yōu)的最優(yōu)工藝條件來(lái)超聲提取鬼燈檠中巖白菜素,同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)為其的提取純化的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

鬼燈擎，巖白菜素(批號(hào)1532-200202)分別為陜西略陽(yáng)縣華瑞杜仲開發(fā)有限責(zé)任公司和中國(guó)藥品生物制品檢定所所生產(chǎn)，其中前者通過(guò)了西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部李智選研究員鑒定。甲醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為重蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

U3000高效液相色譜儀；ME235S-電子分析天平；RE-2000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；H·H·S21-6C電熱恒溫水浴鍋；101A-2型鼓風(fēng)干燥箱；SB-4200DT超聲清洗器；SHB-C循環(huán)水式多用真空泵；LD5-10高速離心機(jī)；FZ102植物粉碎機(jī)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 高效液相色譜法測(cè)定巖白菜素的含量[4、5]色譜條件 色譜柱: Kromasil-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇-水(25∶75)，檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm，流速:1.0 mL·min-1，柱溫:(30±1)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取巖白菜素對(duì)照品，通過(guò)電子分析平精準(zhǔn)稱取10.0 mg樣品，選取規(guī)格為50 mL容量瓶，向其中加入稱好的樣品，然后向容量瓶?jī)?nèi)倒入適量的甲醇，使兩者混合，溶解，最終充分均勻溶液得濃度為0.20 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:對(duì)制作好的對(duì)照品溶液進(jìn)行吸取，吸取量依次為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL，然后注入高效液相色譜儀中，按照上述的色譜條件的標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確計(jì)算并記錄高效液相色譜圖和峰面積。結(jié)果表明巖白菜素其進(jìn)樣量(X,μg)與峰面積(Y)之間存在線性關(guān)系，線性范圍0.1～5.0 μg。

2.1.2 鬼燈擎中巖白菜素提取溶劑及提取方法的比較 取鬼燈擎粉末，精確稱取4份，各10.00 g，按1∶15料液比分別加入95%乙醇、75%乙醇、55%乙醇和水4種不同濃度的乙醇溶劑，浸泡1.0 h，然后在85℃水浴中熱回流提取2.0 h或超聲(20 kHz)提取1.0 h，過(guò)濾，用相應(yīng)濃度的乙醇溶劑將濾液定容至250 mL，最后對(duì)白菜素的濃度進(jìn)行檢測(cè)，采取方式是高效液相色譜法，計(jì)算含量。

2.1.3 鬼燈擎中巖白菜素提取率各單因素的影響 取鬼燈擎粉末準(zhǔn)確稱取10.00 g，選取規(guī)格為250 mL的燒瓶，將稱取的粉末倒入其中，然后將95%乙醇混與其中，在不同的提取時(shí)間、不同的料液比、不同的提取次數(shù)、不同的提取溫度下進(jìn)行超聲提取，過(guò)濾，濾液定容至250mL，用高效液相色譜法測(cè)定溶液中巖白菜素的濃度，計(jì)算含量。確定在不同提取條件下提取因素的變化范圍，以及各因素的最佳參數(shù)。

2.1.4 乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響 取鬼燈擎粉末，精確稱取100.00 g，3份，分別按1∶10料液比浸泡于95%乙醇、75%乙醇和55%乙醇3種不同濃度的乙醇溶劑中1.0 h，然后超聲(20 kHz)提取，其時(shí)間為45 min，總共提取兩次，然后對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾操作，獲得濾液后進(jìn)行減壓濃縮使其沒(méi)有醇味，放涼，用稀酸堿調(diào)pH，析晶，離心得析晶物，烘干測(cè)定得率，最后檢測(cè)其中的巖白菜素的含量。

2.1.5 鬼燈擎中巖白菜素提取率的正交試驗(yàn) 由上述單因素實(shí)驗(yàn)可知鬼燈擎中巖白菜素醇超聲提取法優(yōu)于醇熱回流提取法，參考乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故確定鬼燈擎中巖白菜素采用95%乙醇超聲提取法。采用L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究超聲提取時(shí)間、料液比、超聲提取次數(shù)和超聲提取溫度對(duì)巖白菜素提取的影響，尋找最佳提取參數(shù)。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 提取溶劑及提取方法的比較 巖白菜素的濃度的檢測(cè)，計(jì)算含量所得結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示，在熱回流法中，對(duì)鬼燈擎中巖白菜素的提取能力為95%乙醇>75%乙醇>55%乙醇>水；在超聲法中，對(duì)鬼燈擎中巖白菜素提取能力為95%乙醇>75%乙醇>55%乙醇>水；超聲法提取能力高于熱回流法；尤其是用75%、95%乙醇提取效果最佳，故本實(shí)驗(yàn)確定采用75%、95%乙醇超聲提取法進(jìn)行鬼燈擎中巖白菜素的提取。

2.2.2 鬼燈擎中巖白菜素提取率各單因素的影響 鬼燈擎中巖白菜素提取率各單因素的影響見(jiàn)表2。

表1 鬼燈擎中巖白菜素不同溶劑濃度不同提取方法提取效果的比較

表2 各單因素對(duì)鬼燈擎中巖白菜素提取率的影響

表2表明，巖白菜素醇超聲提取率隨醇超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，45 min后巖白菜素超聲提取率增加緩慢，同時(shí)生產(chǎn)成本也會(huì)隨著時(shí)間的增加而增加，故超聲提取時(shí)間應(yīng)控制在45～60 min為宜；巖白菜素醇超聲提取率隨醇超聲提取料液比的增加而增高，超過(guò)1∶10料液比后，巖白菜素醇超聲提取率隨超聲提取料液比的增加幅度變小。超聲提取料液比的增加會(huì)大大增加溶劑用量，造成生產(chǎn)成本的增加，故超聲提取料液比確定在1∶10為宜；巖白菜素醇超聲提取率提取2、3、4次的效果都好，但提取2次的效果與提取3次、4次的提取率效果增加不明顯，超聲提取次數(shù)增加會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期及溶劑的用量，會(huì)大大增加生產(chǎn)成本，故超聲提取次數(shù)確定在2次為宜；巖白菜素醇超聲提取率隨超聲提取溫度的增加提取率增加緩慢，在55℃后超聲提取率幾乎明顯變化，提取溫度的增加會(huì)增加生產(chǎn)成本，也會(huì)降低超聲提取設(shè)備的壽命，故超聲提取溫度以控制在45～55℃為宜。

2.2.3 乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響 表3顯示95%乙醇提取液含量與75%乙醇提取液含量相差不大，析晶物含量相差也不大，但析晶物得率相差很大，前者的轉(zhuǎn)化率高出后者的42.49%，說(shuō)明在鬼燈擎巖白菜素提取純化中乙醇濃度是影響析晶物得率的關(guān)鍵，故在醇超聲提取中應(yīng)該采用95%乙醇進(jìn)行巖白菜素的提取純化，而不能采用75%乙醇或以下濃度的乙醇進(jìn)行巖白菜素的提取純化。

2.2.4 鬼燈擎中巖白菜素提取率的正交試驗(yàn) 用同樣的方法檢測(cè)巖白菜素的濃度，計(jì)算含量，鬼燈擎中巖白菜素提取率正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，直觀分析和方差分析的結(jié)果分別于表5和表6。

表3 乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響

從直觀分析表5看出，A因素極差最大，B因素, D因素, C因素次之，表明對(duì)鬼燈擎中巖白菜素提取率影響最大的為A因素，其次為B因素、D因素、C因素。從方差分析表6看出，A因素F>F0.01，具有顯著意義，B因素F0.05>F>F0.1，有較顯著意義, C因素和D因素F0.1> F，無(wú)顯著性意義。根據(jù)各因素k的變化率得出：A因素選2水平, B因素選2水平, C因素選3水平, D因素選3水平,即鬼燈擎中巖白菜素醇超聲醇提的條件為A2B2C3D3。

表4 正交表L9(34)及結(jié)果

表5 鬼燈擎中巖白菜素提取率直觀分析結(jié)果

表6 鬼燈擎中巖白菜素提取率方差分析結(jié)果

3 討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、純化實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)鬼燈擎中巖白菜素醇超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)比較,綜合各實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定鬼燈擎中巖白菜素醇超聲提取最佳工藝參數(shù)為選擇在45℃實(shí)驗(yàn)溫度下，以1∶10料液比的比例，在45 min之內(nèi)，用95%的乙醇對(duì)其進(jìn)行超聲提取1到2次。因此醇超聲提取法更加具有優(yōu)勢(shì)，尤其是在時(shí)間、溶劑方面，并且其操作的方式也更加方便。

超聲提取在科技人員的努力下，1～20 t·d-1投料規(guī)模的超聲提取工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備已在生產(chǎn)中推廣使用，因此，不斷完善超聲提取工藝是非常重要的。筆者實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果經(jīng)過(guò)了科學(xué)的論證，有著可靠地的根據(jù)促進(jìn)鬼燈擎的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用，可供工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)借鑒。