PCV2免疫調(diào)節(jié)及遺傳變異研究進(jìn)展

湯智慧，楊 柯，王翠華

(1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.漢中市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 漢中 723102)

1991年在加拿大北部出現(xiàn)由豬圓環(huán)病毒感染而流行的疾病，被命名為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningpigsmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)。2004年至2005年初，魁北克的病例急劇增多并在其他地區(qū)出現(xiàn)蔓延，主要臨床癥狀有呼吸困難、消瘦、腹瀉、體表淋巴結(jié)腫大、黃疸等癥狀[1]，另外還伴有發(fā)熱、咳嗽、胃炎、神經(jīng)癥狀，有時(shí)導(dǎo)致突然死亡，嚴(yán)重流行時(shí)可增加斷奶仔豬的死亡率[2]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)為單鏈環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，全基因組大小1.7kb左右。目前PCV包括3個(gè)血清型，PCV1、PCV2和PCV3[3]。其中ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep和Rep')，ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)，ORF3和ORF4編碼參與細(xì)胞凋亡和抗凋亡的蛋白[4]。衣殼基因(Cap)是系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用最廣泛的基因，應(yīng)用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法將PCV2序列分為5個(gè)基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[5]。PCV2的特點(diǎn)是突變率高，易出現(xiàn)基因型優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)移，研究表明疫苗接種可能對(duì)其進(jìn)化產(chǎn)生一定影響[6]。

在受感染豬體的淋巴組織中可以觀察到巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的數(shù)量增多，血液和免疫器官中B細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)量減少，并且產(chǎn)生廣泛的病變。PCV2是引發(fā)PMWS的重要病因，在世界多地均具有較高的感染率，大多數(shù)豬群為亞臨床感染，只有一部分動(dòng)物表現(xiàn)出顯性感染[7]。自2007年以來，一些商業(yè)疫苗的使用大大減少了PCV2感染造成的經(jīng)濟(jì)損失。但是盡管接種了疫苗，病毒仍然在豬群中傳播蔓延。

一般情況下，機(jī)體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)可以清除病原體并產(chǎn)生免疫記憶。而病毒在進(jìn)化過程中通過一系列機(jī)制來規(guī)避甚至利用機(jī)體免疫系統(tǒng)來完成它們的生命周期。如PCV2能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，導(dǎo)致機(jī)體處于長(zhǎng)期的促炎狀態(tài)，并引起相關(guān)免疫病理反應(yīng)。PCV2感染的結(jié)果在不同個(gè)體之間又有很大的差異。受PMWS影響，豬體出現(xiàn)嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞耗竭，從而引起免疫抑制[8]。近年來，關(guān)于免疫系統(tǒng)參與發(fā)病機(jī)制的研究越來越多，PCV2在進(jìn)化過程中用于逃避免疫防御的機(jī)制也越來越多。

1 PCV2感染后的免疫特性

1.1 細(xì)胞因子對(duì)PCV2感染的免疫調(diào)節(jié)

非特異性免疫應(yīng)答是抵御病原體感染的早期屏障，這種反應(yīng)在病原體侵入后立即被激活。早期反應(yīng)不能清除病原體，就會(huì)引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。在防御PCV2入侵過程中，樹突狀細(xì)胞(DCs)起著重要的作用。DCs和巨噬細(xì)胞是首先對(duì)抗病原體的免疫細(xì)胞，它們通過吞噬作用吞噬病原體，并將抗原提呈給T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生I型干擾素(IFN)[9]。起到抗原提呈作用的樹突狀細(xì)胞分為兩類:傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞(cDC)和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)。PCV2能夠調(diào)節(jié)DC的活性，病毒被DC吞噬，但并不會(huì)在這些細(xì)胞中活躍地復(fù)制，不影響它們的生存[10]。研究表明，PCV2的存在不會(huì)影響傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞(cDC)的功能，但會(huì)影響漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)[11]。在病毒的刺激下pDC產(chǎn)生IFN-α，從而產(chǎn)生抗病毒作用。然而，在體外培養(yǎng)的pDCs/單核細(xì)胞顯示，PCV2可抑制IFN-α的分泌，即使存在IFN-α刺激劑的情況下這種抑制作用仍然存在。而體內(nèi)感染PCV2反而可以誘導(dǎo)IFN-α的分泌[12]。所以PCV2可以同時(shí)具有免疫刺激(體內(nèi)感染)和免疫抑制作用(體外培養(yǎng))。研究表明：一方面，病毒可能通過抑制/刺激CpG基序與細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)或內(nèi)體受體相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子[13]；另一方面，PCV2封閉的基因組ssDNA(促進(jìn)作用)和游離dsDNA(抑制作用)復(fù)制形式之間的平衡決定了PCV2感染的免疫調(diào)節(jié)特性[14]。

在免疫調(diào)節(jié)過程中，另一種起到重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子是IL-10，由固有免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、DC)和適應(yīng)性免疫細(xì)胞(如B細(xì)胞和CD4+ /CD8+T細(xì)胞)產(chǎn)生。IL-10能抑制參與病原體清除作用的細(xì)胞的活性，如巨噬細(xì)胞，Th1 細(xì)胞和NK細(xì)胞[15]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明IL-10在PCV2感染過程中發(fā)揮的重要作用。PCV2可感染體外培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，尤其是單核細(xì)胞/DC/巨噬細(xì)胞群體。IL-10的表達(dá)受到PCV2的誘導(dǎo)，PCV2感染PBMCs后釋放的IL-10可抑制IFN-γ,IFN-α和IL-12 的表達(dá)，這些受抑制的細(xì)胞因子是受到具有記憶功能的抗原刺激產(chǎn)生的[16]。實(shí)驗(yàn)表明，IL-10在該細(xì)胞群中誘導(dǎo)的可能途徑通過toll樣受體9(TLR9)來控制，TLR9是一種識(shí)別非甲基化的內(nèi)源性表達(dá)受體DNA[17]。PMWS感染的豬體胸腺中IL-10的轉(zhuǎn)錄水平升高，這與胸腺耗竭和萎縮有關(guān)。在PMWS感染的豬群中，由PCV2誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-10是導(dǎo)致免疫紊亂的關(guān)鍵細(xì)胞因子，機(jī)體IL-10的分泌與PMWS相關(guān)，全身IL-10水平與感染后21d血液中的病毒量也有關(guān)系?？傊?，體外實(shí)驗(yàn)可以通過識(shí)別固有細(xì)胞類型，對(duì)細(xì)胞因子分泌的早期進(jìn)行研究；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以研究病毒感染對(duì)組織和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-10是影響固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，也是出現(xiàn)PMWS的重要原因之一。

1.2 PCV2感染后的特異性免疫應(yīng)答

從胚胎到個(gè)人發(fā)育過程中，關(guān)于PCV2引起的體液免疫應(yīng)答機(jī)制研究得較成熟。一方面由于血清樣本較容易獲得，使用常規(guī)方法就能檢測(cè)出PCV2抗體；另一方面源于疫苗研制過程中對(duì)具有免疫原性的衣殼蛋白的深入研究。母畜妊娠期感染PCV2，在妊娠70d左右即可產(chǎn)生針對(duì)PCV2的體液免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生特異性抗體[18]。也有研究表明母畜妊娠前感染PCV2，在妊娠期可通過胎盤將病毒傳播給胎兒，并在胎兒體內(nèi)檢測(cè)出一定載量的病毒。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)PCV2感染引起流產(chǎn)機(jī)制的研究具有重要意義，因?yàn)椴《究赡軆H僅來源于母體，目前還需要更多數(shù)據(jù)來證明這一發(fā)現(xiàn)。出生后，由于在初乳中存在母源抗體，仔豬可以免受PCV2侵襲。中和抗體可以有效地清除病毒并阻礙其復(fù)制。這些通過被動(dòng)免疫獲得的抗體,滴度在哺乳過程中會(huì)逐漸下降，母源抗體的減少使動(dòng)物再次易受PCV2感染。然而抗體滴度下降后便會(huì)導(dǎo)致PCV2復(fù)制的增加、嚴(yán)重的淋巴樣病變，甚至引發(fā)PMWS[19]。在感染過程中，抗體主要針對(duì)Cap蛋白產(chǎn)生，同時(shí)也針對(duì)非結(jié)構(gòu)Rep蛋白產(chǎn)生。在健康和PMWS感染的豬群中，抗Cap抗體產(chǎn)生較早，且其滴度高于抗非結(jié)構(gòu)Rep抗體。

然而，PCV2抗體對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用是有限的，細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用也不容忽視。IFN-γ分泌細(xì)胞(SC)的發(fā)現(xiàn)，已證實(shí)其與血清中PCV2病毒載量呈負(fù)相關(guān)。PCV2特定IFN-γ-SCs為T細(xì)胞，在抗原的刺激下能產(chǎn)生夠產(chǎn)生IFN-γ,其水平可用來評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能。在PCV2感染或注射疫苗后IFN-γ產(chǎn)生的量有所增加。并且IFN-γ-SCs對(duì)非結(jié)構(gòu)Rep蛋白和結(jié)構(gòu)Cap蛋白的作用都是特異性的[20]。PCV2感染引起的PMWS病豬均出現(xiàn)B細(xì)胞和T細(xì)胞減少的現(xiàn)象(包括B淋巴細(xì)胞和CD3+CD4+、CD3+CD8+記憶/活化的Th淋巴細(xì)胞的減少)。另外，疫苗接種和感染都會(huì)誘發(fā)記憶/活化Th細(xì)胞的產(chǎn)生?？乖禺愋杂洃汿細(xì)胞在病毒感染和疫苗接種后長(zhǎng)期存在，再次接受抗原刺激后能夠快速擴(kuò)增并產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答來對(duì)抗PCV2的感染。在疫苗接種或病毒感染后，產(chǎn)生的PCV2特異性CD4+T細(xì)胞，能夠產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，這些細(xì)胞因子在抵御和清除PCV2感染過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明，所有接種疫苗或受PCV2感染的豬體內(nèi)均產(chǎn)生了這些細(xì)胞因子，但是特異性抗體的產(chǎn)生率僅僅不到45%[21]。這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞免疫在防御和清除感染動(dòng)物PCV2中的重要性。

2 PCV2病毒的變異

PCV2是引起豬群疾病重要的豬病原體之一，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，PCV2疫苗廣泛應(yīng)用于大型農(nóng)場(chǎng)，在一定程度上產(chǎn)生了免疫效應(yīng)，但無法完全抵御PCV2的感染，病毒仍然出現(xiàn)持續(xù)傳播的趨勢(shì)。在接種疫苗的豬群中，PCV2復(fù)制比(R0)約為1.5，而在未接種疫苗的豬中(R0)為5.2。因?yàn)镽0測(cè)量的是個(gè)體感染病毒后感染水平的平均值，R0 > 1表示該病原體在種群內(nèi)持續(xù)存在。因此，PCV2疫苗在降低感染力方面非常有效，但不能清除環(huán)境中出現(xiàn)的病毒[22]。

通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，依據(jù)Cap基因?qū)CV2分為五種基因型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[23]。早在2000年，PCV2a是農(nóng)場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)的最廣泛流行的基因型，隨即被PCV2b基因型取代并且引起了嚴(yán)重的PMWS暴發(fā)。PCV2c最初在丹麥發(fā)現(xiàn)，農(nóng)場(chǎng)的發(fā)生概率比較低。PCV2d已經(jīng)出現(xiàn)，有人認(rèn)為其顯性基因型新的轉(zhuǎn)移可能會(huì)持續(xù)進(jìn)行。據(jù)估計(jì)，PCV2b和PCV2d出現(xiàn)于大約20年前，與出現(xiàn)全球性PMWS爆發(fā)的時(shí)間吻合。基因型遺傳趨異分析反映了不同基因型在豬群中流行的時(shí)間，PCV2a遺傳趨異程度最高，其次是PCV2b和PCV2d。各個(gè)基因型間的全基因組差異約為8% ～ 12%，其中PCV2c差異最大，其次為PCV2d。幾種基因型的衣殼蛋白氨基酸序列差異在6% ～ 15%之間[24]。PCV2的變異性由其高變異率決定，自然選擇進(jìn)一步加速了其變異速度。事實(shí)上，由于Cap基因的突變，新的抗原變異已經(jīng)出現(xiàn)。新一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)測(cè)定出低頻突變，低頻突變體不適合在既定環(huán)境中生存，但會(huì)形成儲(chǔ)存體，使病毒快速適應(yīng)不斷變化的外界環(huán)境。有時(shí)可能發(fā)生有益突變，并迅速增加它們?cè)诓《痉N群中的分布。Rap基因具有較高的保守性，而Cap基因具有較大的變異性。研究表明，來自不同豬群的多克隆血清與來自單一基因型的隔離群相比，前者具有不同水平的中和抗體。另外，在Cap蛋白中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)線性表位(25-43、69-83、113-127、117-131、169-183和193-207殘基)和構(gòu)象表位(47-85、165-200和230-233殘基)[25]。這些區(qū)域包含了在陰性和陽(yáng)性選擇下的位點(diǎn)，尤其是非保守位點(diǎn)處于陽(yáng)性選擇狀態(tài)，被認(rèn)為是宿主免疫系統(tǒng)的靶向位點(diǎn)。PCV2蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域是其功能的關(guān)鍵區(qū)域，這些區(qū)域中的位點(diǎn)發(fā)生的任何突變對(duì)病毒都是不利的。

目前的研究正在進(jìn)一步了解疫苗接種對(duì)PCV2進(jìn)化的長(zhǎng)期影響。一些事實(shí)表明疫苗的接種可以促進(jìn)PCV2的進(jìn)化。在美國(guó)、德國(guó)和西班牙等重要的生豬生產(chǎn)國(guó)，疫苗接種得到了廣泛的應(yīng)用，據(jù)統(tǒng)計(jì)90%以上的動(dòng)物都接種了疫苗。但是由于豬群的密度很高，任何傳染病都能迅速傳播。此外，由于疫苗不能完全預(yù)防PCV2的感染，盡管接種了疫苗，農(nóng)場(chǎng)中PCV2仍在繼續(xù)蔓延傳播。已有證據(jù)表明，在接種疫苗和未接種疫苗的農(nóng)場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)的PCV2種群在其基因組組成上存在差異[26]。此外，接種疫苗的豬群中也發(fā)現(xiàn)了新的PCV2d分離株，并且這些感染的豬群患有PMWS。實(shí)驗(yàn)證明，針對(duì)PCV2a的疫苗對(duì)PCV2d是有效的。目前，仍需要更多的工作來研究疫苗接種在病毒進(jìn)化過程中的作用，特別是在接種疫苗的動(dòng)物中出現(xiàn)疾病的病例。

3 小結(jié)

大多數(shù)豬體都有有效的免疫機(jī)制來清除或抑制PCV2的感染。未感染PCV2的健康豬群通過體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答來清除并限制病毒。中和抗體的滴度與PCV2復(fù)制增加、嚴(yán)重淋巴樣病變和PCV2系統(tǒng)性疾病(PMWS)的發(fā)生有關(guān)。自然感染或接種疫苗后，抗原特異性細(xì)胞能長(zhǎng)期存活，并能在抗原識(shí)別記憶性T細(xì)胞控制PCV2 感染中起重要作用。但是，仍有一定比例的豬群可能無法抵抗感染并發(fā)展成PMWS。如今，有效的疫苗接種可以在一定程度上控制疾病的發(fā)展。接種疫苗可以啟動(dòng)免疫系統(tǒng)，當(dāng)遇到PCV2病毒時(shí)，可以迅速有效地激活免疫應(yīng)答。由于疫苗并不能完全預(yù)防PCV2感染，考慮到病毒的突變能力，在疫苗接種的情況下出現(xiàn)PCV2的進(jìn)一步進(jìn)化是非常有可能的。另外，疫苗的接種對(duì)PCV2的進(jìn)化產(chǎn)生一定影響，并出現(xiàn)新的分離株。