海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞生長性能、腸道形態(tài)和免疫功能的影響

李玲茜，惠俊楠，吳 旻，蘭海楠，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

益生菌作為飼料添加劑，因其具有無殘留、無抗藥性、不污染環(huán)境、提高動物生長等優(yōu)點[1]成為當(dāng)前研究重點，并廣泛應(yīng)用于家禽生產(chǎn)中，主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和腸球菌等類別?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis，BS）為革蘭氏陽性需氧菌，以孢子狀態(tài)存在，其孢子對苛刻條件的抵抗力強，環(huán)境溫度下可長期儲存[2]。枯草芽孢桿菌通過胃酸環(huán)境后能維持良好活性，并抵達動物腸道發(fā)揮功效[3]?？莶菅挎邨U菌單獨或復(fù)合添加均具有改善腸道菌群、增強免疫功能、促生長等功效[1,4-5]。

海洋紅酵母菌（Rhodotorula benthica）是自然界普遍存在的單細胞酵母品系，也是一類抗逆性較強的腐生菌[6]。海洋紅酵母菌富含多種活性物質(zhì)和營養(yǎng)因子，培養(yǎng)可產(chǎn)生多種類胡蘿卜素，是具有潛力的動物飼料添加劑和天然色素源[7-8]，能夠刺激宿主消化道內(nèi)有益菌的生長繁殖，改善宿主的生產(chǎn)機能和健康狀態(tài)，提高養(yǎng)分吸收率和抗氧化能力[4]。然而，海洋紅酵母菌多應(yīng)用于水產(chǎn)研究。Wang等[9]研究證明，飼糧中添加芽孢桿菌和膠紅酵母能改善幼年大西洋鮭的生長性能和抗病能力。Wang等[7]研究表明，飼糧中添加海洋紅酵母能提高凡納對蝦的生長性能和抗氧化能力。但枯草芽孢桿菌和海洋紅酵母菌復(fù)合使用對蛋雛雞的影響研究較少。為此，本試驗旨在探究枯草芽孢桿菌和海洋紅酵母菌單獨和聯(lián)合使用對海蘭褐蛋雛雞生長性能、腸道形態(tài)以及免疫功能的影響，為復(fù)合益生菌制劑在蛋雛雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 1.6×108CFU/kg海洋紅酵母菌、6.7×1010CFU/kg枯草芽孢桿菌由吉林省農(nóng)科院提供，復(fù)合益生菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖實驗室自制（本試驗經(jīng)預(yù)處理后確定添加量）。試驗用海蘭褐蛋雛雞及基礎(chǔ)飼糧由扶余禾豐公司提供。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 選取體重（38.41±0.1）g的1日齡海蘭褐蛋雛雞396只，隨機分為4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)33只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加的活菌數(shù)分別為1×108CFU/kg海洋紅酵母菌、1×1010CFU/kg枯草芽孢桿菌和復(fù)合益生菌（1×108CFU/kg海洋紅酵母菌+1×1010CFU/kg枯草芽孢桿菌）。采用3層籠養(yǎng)方式，試驗期28 d?；A(chǔ)飼糧參照NRC（1994），并結(jié)合《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33 2004）配制見表1。試驗期間自由采食，飲水充足，日常雞舍管理方案和相關(guān)免疫程序依照扶余禾豐公司育雛雞場規(guī)范實行。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能 于試驗第1、7、14、21、28天08:00空腹稱重。稱重前一天20:00斷料，飲水自由。試驗期間準(zhǔn)確記錄投料量，每周以各重復(fù)為單位統(tǒng)計體重、余料量（采用精度為0.1 g的電子秤稱量），記錄平均日增重、平均日采食量、耗料增重比。

1.3.2 腸道形態(tài) 于試驗第28天，每組挑選9只蛋雛雞頸靜脈采血，屠宰后取出完整腸道，分離取十二指腸、空腸和回腸（約5 cm），0.9%生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定。組織塊經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色和封片，OLYMPUS-CX31生物顯微鏡下觀察腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，挑選多個非連續(xù)性視野觀察切片，將典型視野拍照保存，測量絨毛高度和隱窩深度，計算絨腺比。

1.3.3 血清免疫球蛋白 于試驗第28天，每組挑選9只蛋雛雞頸靜脈采血，收集的全血靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，分離的血清于-20℃保存?zhèn)溆?。采用購于酶免有限公司的ELISA試劑盒測定血清中IgA、IgG和IgM含量。

1.3.4 腸黏膜免疫因子 于試驗第28天，每組挑選9只蛋雛雞屠宰后取出完整腸道，分離出空腸，0.9%生理鹽水沖洗內(nèi)容物后載玻片刮取黏膜，-80℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR檢測各組空腸黏膜TNF-α、IL-2、IL-4及IL-6mRNA的相對表達量，以β-肌動蛋白（β-actin）作內(nèi)標(biāo)，采用2-△△CT法計算。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國GeneCoPoeia公司，SYBR Premix Ex TaqTM購于日本TaKaRa公司，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。

表2 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），運用Duncan′s法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05判斷差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞生長性能的影響 由表3可知，各組蛋雛雞在試驗1～14日齡的平均日采食量、平均日增重和耗料增重比無顯著差異；在15～28日齡階段，復(fù)合益生菌組的平均日增重高于對照組（P＜0.05），耗料增重比低于對照組（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組的平均日增重高于對照組（P＜0.05）；在1～28日齡階段，復(fù)合益生菌組的平均日增重高于對照組（P＜0.05）。

2.2 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞腸道形態(tài)的影響 由表4可知，與對照組比，添加復(fù)合益生菌能提高十二指腸絨毛高度和絨腺比（P＜0.05），且各試驗組有降低隱窩深度的趨勢（P＞0.05）；復(fù)合益生菌組蛋雛雞空腸絨毛高度及絨腺比提高（P＜0.05），而添加枯草芽孢桿菌僅提高了空腸絨毛高度（P＜0.05），各試驗組有降低隱窩深度的趨勢（P＞0.05）；各試驗組均能改善回腸的絨毛高度和絨腺比，并降低隱窩深度（P＞0.05）。由圖1可以看出，各組腸絨毛完整性良好，絨毛排列整齊。

2.3 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞血清免疫球蛋白的影響 由表5可知，復(fù)合益生菌組血清IgA含量高于對照組（P＜0.05）；復(fù)合益生菌組血清IgG含量高于對照組和海洋紅酵母組（P＜0.05）；各組血清IgM含量無顯著差異。

2.4 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞腸道免疫因子的影響 由圖2可知，各組空腸TNF-αmRNA相對表達量無顯著差異。與對照組比，各試驗組空腸IL-2mRNA相對表達量均有提高趨勢（P＞0.05）；海洋紅酵母組和復(fù)合益生菌組空腸IL-4mRNA相對表達量提高（P＜0.05），試驗組間差異不顯著；枯草芽孢桿菌組和復(fù)合益生菌組提高空腸IL-6mRNA相對表達量（P＜0.05），試驗組間差異不顯著。

3 討 論

3.1 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞生長性能的影響 益生菌隨飼糧進入消化道后，能夠維持腸道菌群平衡，促進有益菌生長，還能降低有毒物質(zhì)的積累[4]。此外，益生菌產(chǎn)生的多種酶類和營養(yǎng)物質(zhì)，促進消化并提高養(yǎng)分吸收比，可改善機體的生長性能[10]。本試驗中，與對照組相比，枯草芽孢桿菌組蛋雛雞15～28日齡平均日增重提高，復(fù)合益生菌組15～28日齡和1～28日齡的平均日增重顯著提高，15～28日齡的耗料增重比顯著降低。余東游等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌提高了羅斯308肉雞1～42日齡的平均日增重，主要通過22～42日齡平均日增重體現(xiàn)出來。陸銀等[11]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌對1～21日齡和1～35日齡的肉雞生長性能無顯著作用，但能提高21～35日齡試驗組的生長性能。這與本試驗結(jié)果一致。益生菌的添加對前期作用不顯著，這可能是因為蛋雛雞早期腸道功能體系尚未完善，益生菌在胃腸道中增殖、發(fā)揮功效需要一定時間。Yeo等[12]認(rèn)為，益生菌對肉雞的促生長作用體現(xiàn)在飼養(yǎng)前期，在飼養(yǎng)后期和全期未發(fā)現(xiàn)顯著促生長效果，這可能是所用雞的品種、菌株、飼喂方式、飼養(yǎng)環(huán)境不同帶來的差異。

表3 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞生長性能的影響

表4 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞小腸道形態(tài)的影響

表5 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞免疫球蛋白的影響

3.2 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞腸道形態(tài)的影響 小腸在營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運方面起主要作用[13]，是機體抵御有害物質(zhì)和病原微生物的保護屏障，良好且完整的腸道形態(tài)是維持機體健康生長的重要保障[14]。小腸絨毛高度增加，食糜吸收面積增大，吸收能力增加；隱窩變淺，成熟細胞數(shù)量增加，消化能力隨之加強。絨腺比綜合反映小腸的功能狀況，比值升高，表明小腸消化吸收功能增強，腸道結(jié)構(gòu)改善。Sen等[2]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌LS可改善十二指腸和回腸中絨毛高度及絨腺比，改善腸道結(jié)構(gòu)。Aliakbarpour等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加益生菌可提高空腸絨毛高度及粘蛋白基因的表達。本試驗表明，與對照組比，基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)合益生菌能有效提高十二指腸和空腸的絨毛高度及絨腺相比，降低隱窩深度，對回腸影響不顯著。

益生菌隨飼糧進入消化道后，能提高機體多種酶類物質(zhì)的活性，富含多種活性代謝產(chǎn)物[4,16]，便于機體消化和利用飼糧中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進腸道黏膜發(fā)育。此外，益生菌能改善腸道黏液分泌，增強上皮細胞的緊密連接，調(diào)節(jié)腸道上皮細胞增殖與分化，修復(fù)受損腸道[14]。最后，益生菌通過消耗腸道內(nèi)的氧氣促進厭氧菌的生長，而枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌肽[5]等代謝產(chǎn)物并激活酸性蛋白酶活性[10]、海洋紅酵母菌細胞壁的活性成分甘露寡糖[17]為病原菌提供附著源，共同抑制病原菌的繁殖，減少對腸黏膜的損傷，改善腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3.3 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞血清免疫球蛋白的影響 血清免疫球蛋白含量是體現(xiàn)動物機體免疫功能的重要標(biāo)志。IgG在體液免疫中發(fā)揮作用，具有抗細菌、病毒和外毒素等活性功能。IgM是機體受抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體，在感染早期起主要的免疫作用。血清型IgA含量較低，分泌型IgA參與黏膜局部免疫，在局部抗感染中發(fā)揮作用。余東游等[5]研究指出，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高肉雞血清中IgG含量及免疫器官指數(shù)，通過提高肉雞的免疫功能而改善其生長性能。Vinderola等[18]報道，芽孢菌能促進小鼠B細胞增殖和sIgA的分泌，提高免疫水平。本試驗結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧中添加益生菌可以提高蛋雛雞血清IgG、IgA含量，其中復(fù)合益生菌組效果最好。原因可能是，海洋紅酵母細胞壁所含的甘露寡糖和葡聚糖具有刺激細胞和體液免疫的作用[6]，芽孢桿菌的菌體成分（如胞壁糖、肽聚糖和多肽等）可作為抗原刺激腸道作用于機體免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)免疫器官的生長發(fā)育[5]。并且益生菌在消化道內(nèi)大量繁殖，代謝過程中產(chǎn)生多種營養(yǎng)因子[16]，也可作用于機體免疫系統(tǒng)。

3.4 海洋紅酵母菌和枯草芽孢桿菌對蛋雛雞腸黏膜免疫因子的影響 IL-2由活化的CD4+T細胞及CD8+T細胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物活性，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子；IL-4由II型輔助T細胞分泌，其主要功能是刺激B細胞活化和T細胞增殖，在調(diào)節(jié)體液免疫和獲得性免疫中起關(guān)鍵作用；IL-6 由單核細胞、T和B淋巴細胞、成纖維細胞等產(chǎn)生，能使B淋巴細胞分化為成熟的漿細胞。IL-2、IL-4、IL-6的分泌細胞主要分布在腸黏膜固有層，在免疫應(yīng)答的反應(yīng)階段，促進T、B細胞的活化、增殖與分化。TNF-α主要由活化的單核細胞或巨噬細胞產(chǎn)生，能殺傷和抑制腫瘤細胞、抗感染等。益生菌刺激某些免疫相關(guān)細胞因子產(chǎn)生的研究已有報道。曹晉宜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠連續(xù)15 d灌胃瑞士乳桿菌，其小腸IL-2、IL-4、IL-6 含量顯著增加。李云鋒等[20]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能促進仔豬十二指腸IL-6和TNF-α以及回腸IL-1mRNA相對表達量，證明了芽孢桿菌本身可以刺激小腸黏膜免疫因子的表達。本試驗研究表明，基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)合益生菌能上調(diào)IL-4和IL-6mRNA相對表達量，提高了空腸黏膜免疫因子的表達。這可能是由于枯草芽孢桿菌在動物腸道內(nèi)萌發(fā)繁殖，能黏附在小腸黏膜表面，激發(fā)免疫反應(yīng)[21-23]，促使巨噬細胞和B、T 淋巴細胞釋放免疫因子，由淋巴細胞途徑激活機體免疫體系，提高動物的免疫功能[4]。海洋紅酵母細胞壁的活性成分具有刺激細胞和體液免疫的作用[6]，葡聚糖可以增強巨噬細胞和嗜中性粒細胞的遷移和吞噬[24]，提高動物抵抗病原的能力[25]。復(fù)合益生菌共同作用于小腸，刺激機體內(nèi)巨噬細胞的活化和數(shù)量的增多，有利于增強機體的免疫功能。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，添加復(fù)合益生菌可有效提高蛋雛雞生長性能、改善腸道形態(tài)、增加血清免疫球蛋白含量及空腸黏膜免疫因子mRNA相對表達量。