長白豬CIDEB基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

孫 健，郭振清，王麗敏，杜金友，李紅強(qiáng)*

(1.河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北昌黎 066600；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050024）

豬肉作為我國肉類的主要來源，占我國肉類總產(chǎn)量的60%以上[1]，然而豬肉品質(zhì)與我國消費(fèi)者的消費(fèi)預(yù)期有很大差距。研究表明，肥胖即脂質(zhì)過度積累是影響豬肉品質(zhì)的重要因素，同時(shí)肥胖也會引起多種代謝性相關(guān)性疾病，如二型糖尿病、心腦血管疾病、脂肪肝等。動物的脂肪沉積取決于TAG（Triacylglycerol）合成和儲存水平以及脂質(zhì)動員和脂肪酸氧化水平[2]。TAG不僅是能量儲存的主要形式，也可以避免過量的脂肪酸對其他細(xì)胞器產(chǎn)生脂毒性[2]，它儲存于脂滴中為機(jī)體提供能源和碳源。

CIDE家族基因（Cell Death-Inducing DNA Fragme ntation Factorα-like Effector）調(diào)控機(jī)體脂肪組織和肝臟的脂肪代謝，并且與一些疾病產(chǎn)生相關(guān)，該家族包括CIDEA、CIDEB以及CIDEC/Fsp27（Fat-Specific Protein 27）3個(gè)成員。CIDE家族分布在不同的組織中，CIDEA在棕色脂肪組織表達(dá)量最高，在白色脂肪、心臟等組織中也有微量表達(dá)；CIDEC則在白色脂肪組織表達(dá)量最高[4]；CIDEB在機(jī)體各組織中都有一定的表達(dá)，但在肝臟中表達(dá)量最高[5]。利用基因敲除技術(shù)將CIDEB敲除后，小鼠表現(xiàn)出胰島素敏感性增加、脂肪及脂肪酸合成減少等特點(diǎn)，并且證實(shí)CIDEB和ADRP相互作用參與調(diào)控肝臟VLDL（pre-very-low-density lipoprotein）脂化成熟及脂穩(wěn)態(tài)。本文選擇長白豬為研究對象，構(gòu)建CIDEB基因的全長真核表達(dá)載體并進(jìn)行序列分析，為CIDEB在豬中的遺傳特性及蛋白功能活性的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選自河北省昌黎縣肉聯(lián)廠6月齡去勢長白豬，取其新鮮肝臟于-80℃保存。

1.1.2 載體和菌株 pcDNA3.1+空載體來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大腸桿菌DH5α菌株為河北科技師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 工具酶和主要生化試劑 DEPC（焦碳酸二乙酯）、GoldenView購置于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Trizol、dNTP、5X buffer、MIV、RNA抑制劑、DL2000 DNA Ladder、2×Es Taq Master Mix（含染料）、DNA凝膠回收試劑盒購置于索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、無水乙醇、氯仿、異丙醇、苯酚、異戊醇購置于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 特異性引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬基因編碼序列（登錄號：NM_001112688.1），使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性正、反向引物，第一對引物不含有酶切位點(diǎn)，第2對引物含有酶切位點(diǎn)，引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA合成 用Trizol提取長白豬肝臟的總RNA，用Nanodrop及瓊脂糖電泳法檢測RNA的純度和完整性，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增與DNA片段回收 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系10 μL：3.0 μL H2O、100 ng/μL模板1.0 μL、10 pmol/L上下游引物各0.5 μL、2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL。擴(kuò)增程序設(shè)置為95℃，5 min；95℃30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，5 min；20℃，5 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測，用膠回收試劑盒將PCR目的片段回收。

1.2.4 質(zhì)粒與目的片段酶切和連接處理 加入相應(yīng)量回收后的DNA片段及pcDNA3.1+載體，再加入2 μL Buffer、1 μL KpnI、1 μL XhoI，無菌水補(bǔ)充至20 μL，放在37℃過夜培養(yǎng)。加入酶切后的DNA和pcDNA3.1+載體，比例為3:1，再加入1 μL Buffer、1 μL T4 DNA連接酶輕柔顛倒混勻后置于16℃干式恒溫箱中培養(yǎng)約8～12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐抗生素的固體LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)酶切和PCR擴(kuò)增鑒定，篩選陽性重組單克隆測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 用ORF finder分析并找到序列的ORF區(qū)（開放讀碼框架）。通過ProtParm、Protscale和TMHMM分別對長白豬CIDEB蛋白的理化性質(zhì)、疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，應(yīng)用OCTOPUS在線軟件預(yù)測蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。利用SOPMA和Phyre 2對蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用Conserved Domains對蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。用EMBL-EBI對所獲得的豬及其他物種的CIDEB基因CDS及編碼氨基酸同源性進(jìn)行分析。通過Clustal X和MEGA4.0軟件對其構(gòu)建生物進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 CIDEB真核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1CIDEB基因的克隆 利用Trizol提取長白豬肝臟組織中RNA，經(jīng)測定RNA濃度為704.7 ng/μL。以上述RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并利用表1中的第1對特異性引物進(jìn)行PCR獲取CIDEB基因編碼區(qū)序列（圖1-A），在750 bp左右條帶清晰完整且無非特異性條帶，與理論產(chǎn)物大小一致。將上述片段回收，以此為模板利用表1中的第2對特異性引物進(jìn)行PCR獲取CIDEB基因編碼區(qū)序列（圖1-B），序列大小在660 bp左右，與預(yù)期相符合。

2.1.3 重組載體轉(zhuǎn)化及載體鑒定 將限制性內(nèi)切酶處理后的目的基因和pcDNA3.1+載體連接后，轉(zhuǎn)化到DH5α中，培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定并提取質(zhì)粒。結(jié)果顯示，在小于750 bp附近條帶清晰完整且無非特異性條帶。提取相應(yīng)菌落的質(zhì)粒電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶清晰完整。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切后發(fā)現(xiàn)有兩條清晰的條帶。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與NCBI（登錄號：NM_001112688.1）中豬的CIDEB基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果完全一致。

表1 PCR引物

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 長白豬CIDEB蛋白理化性質(zhì)和疏水性分析 由ORF finder預(yù)測得知，豬CIDEB基因編碼219個(gè)氨基酸。經(jīng)在線預(yù)測軟件ProtParm分析CIDEB蛋白的理化性質(zhì)，可知其蛋白的分子質(zhì)量為24.653 ku，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為23，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為28，故整個(gè)蛋白質(zhì)帶正電荷。CIDEB分子式為C1097H1759N309O318S9，原子總數(shù)為3 492。理論等電點(diǎn)（PI）為9.13。CIDEB水溶液在280 nm處的消光系數(shù)為31 065，對光的吸收程度較大。CIDEB不穩(wěn)定系數(shù)是47，即長白豬CIDEB屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為92.60，并且CIDEB蛋白半衰期在動物細(xì)胞可達(dá)30 h。肽鏈N端為甲硫氨酸（Met），肽鏈C端為酪氨酸（Tyr），遵循N-端規(guī)則。由長白豬CIDEB蛋白的氨基酸殘基組成可知（表2），氨基酸殘基中頻率最高的是亮氨酸（Leu，占15.53%），頻率最低的是半胱氨酸（Cys，占1.37%），不含有吡咯賴氨酸（Pyl）及硒半胱氨酸（Sec）。通過Protscale在線軟件對長白豬CIDEB蛋白做疏水性分析（圖2），該氨基酸序列縱坐標(biāo)多于0值以上，為親水性殘基，平均疏水指數(shù)為-0.323，因此蛋白整體表現(xiàn)為親水性。

表2 長白豬CIDEB蛋白的氨基酸組成

2.2.2 長白豬CIDEB蛋白跨膜區(qū)預(yù)測及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測通過TMHMM在線分析軟件對長白豬CIDEB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[6]，結(jié)果顯示該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。使用OCTOPUS預(yù)測其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無跨膜區(qū)域，進(jìn)一步印證了長白豬CIDEB蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2.3 長白豬CIDEB蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用SOPMA對長白豬CIDEB蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖3），α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。用Phyre 2預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)（圖4），其與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白具有82%的相似性，具有100%的可信度。

2.2.4 長白豬CIDEB蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測 使用Conserved Domains對蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CIDEB只包含1個(gè)超家族保守結(jié)構(gòu)域；CIDE-N超家族結(jié)構(gòu)域位于30～115位氨基酸殘基。

2.2.5 同源性比對分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 用EMBLEBI分析軟件對所獲得的豬及其他物種的CIDEB基因CDS及編碼氨基酸同源性進(jìn)行分析[7-8]。分析如圖5及表3所示，豬與人、褐家鼠、小家鼠、獼猴、家牛、家馬、猩猩、家犬、熊貓的CIDEB基因CDS的相似性在62.5%以上，與家牛的相似性高達(dá)89.5%。豬與人、褐家鼠、小家鼠、獼猴、家牛、家馬、猩猩、家犬、熊貓的CIDEB氨基酸序列相似性在74.8%以上，其中與家犬和熊貓的相似性最高為92.8%，在所有比對物種的氨基酸序列一致性最高為86.3%。

從進(jìn)化樹可以看出，豬CIDEB與家牛同處在獸類的分支上，相互之間同源性要高于靈長類。也可發(fā)現(xiàn)CIDEB蛋白人與獼猴的同源性要高于人與豬的同源性。

3 討 論

CIDEB基因的研究目前集中在小鼠中[9-10]，在其他動物中的研究相對較少[11]。小鼠CIDEB基因的CDS序列為660 bp，編碼219個(gè)氨基酸，通過序列比較得知，長白豬與小鼠CIDEB基因的CDS核苷酸數(shù)目和編碼氨基酸數(shù)目相同，且氨基酸同源性達(dá)到89.1%，該結(jié)果預(yù)示豬與小鼠CIDEB具有類似功能。本文進(jìn)一步對靈長類、嚙齒類、哺乳動物等物種的CIDEB氨基酸進(jìn)化關(guān)系對比發(fā)現(xiàn)，豬與家牛進(jìn)化關(guān)系最高。人與小鼠的CIDEB蛋白同源性要高于人與豬的同源性，且哺乳類、靈長類、嚙齒類、馬等在系統(tǒng)樹上呈現(xiàn)出4個(gè)不同的進(jìn)化方向，由此可見CIDEB在不同物種間的同源性與他們的親緣關(guān)系呈正相關(guān)，在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，這也是其在各個(gè)物種中功能相似的分子基礎(chǔ)。CIDE家族成員在不同組織中表達(dá)，包括棕色脂肪組織、白色脂肪組織和肝臟[12]，其中CIDEB在肝臟和腸道中均表達(dá)[13]。CIDEB在肝臟中高表達(dá)預(yù)示著其在肝臟的能量代謝和機(jī)體新陳代謝的平衡中起作用。CIDEB基因敲除小鼠白色脂肪組織比重降低，血漿中TAG和脂肪酸的含量顯著降低，胰島素水平也有降低，胰島素敏感性增強(qiáng)，機(jī)體新陳代謝水平顯著增強(qiáng)[14]。在CIDEB缺失的小鼠肝臟中，調(diào)節(jié)脂肪酸合成的重要轉(zhuǎn)錄因子SREBP1c表達(dá)水平下調(diào)且入核量也顯著減少，導(dǎo)致其下游基因ACC1、ACC2、FAS、SCD的表達(dá)水平顯著下調(diào)，使得肝臟中脂肪酸合成水平大大降低；同時(shí)CIDEB缺失的小鼠肝臟中脂肪酸的氧化速率升高，這2個(gè)因素共同作用使肝臟脂肪含量的減少，表現(xiàn)為CIDEB對高脂飲食引起的脂肪肝有抵抗作用[13]。CIDEB基因敲除以后，在禁食條件下小鼠肝臟中的脂肪有明顯增加，血脂含量明顯減少，肝臟脂肪的分泌速率也顯著降低，該結(jié)果表明了CIDEB在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮了重要作用。本文對蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)CIDEB只包含1個(gè)超家族保守結(jié)構(gòu)域，位于30～115位氨基酸殘基，推測該位置在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面具有重要的功能。

表3 不同物種CIDEB基因CDS及編碼氨基酸同源性分析

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆出了豬CIDEB基因編碼區(qū)序列，并構(gòu)建真核表達(dá)載體，長白豬的CIDEB蛋白與靈長類、嚙齒類CIDEB蛋白的分子量差異較為明顯，但與熊貓、家犬、家牛等哺乳動物無明顯差異。長白豬CIDEB是由219個(gè)氨基酸組成的帶正電荷的親水性蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，在生物進(jìn)化過程中具有較強(qiáng)的保守性。