瘤胃微生物宏組學(xué)分析及研究進(jìn)展

蓋葉頂，王后福，王淑玲，矣 國，李鵬飛，楊仁輝，周榮康，楊 振，成 瀟，冷 靜

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

反芻動(dòng)物瘤胃是由細(xì)菌、真菌、古菌、原蟲、病毒等多種微生物共同參與、具有發(fā)酵功能的復(fù)雜器官，可將纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化成反芻動(dòng)物日?；顒?dòng)所需能量，在調(diào)節(jié)宿主生理功能、代謝反應(yīng)和抵御病原體等方面發(fā)揮著重要作用。相比傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)研究方法，宏組學(xué)研究通常旨在確定一組微生物、基因、變異體、途徑或代謝功能，以描述未培養(yǎng)樣本中的微生物群落[1]，因此利用宏組學(xué)策略能在系統(tǒng)層面解釋微生物-宿主之間的相互作用及代謝途徑，以更好分析瘤胃微生物在飼料利用率、功能基因篩選、減少畜牧業(yè)污染中的作用。本文介紹了近年來宏組學(xué)方法在反芻動(dòng)物瘤胃微生物上的應(yīng)用，為宏組學(xué)在瘤胃微生物研究上的運(yùn)用提供參考和依據(jù)。

1 宏組學(xué)

宏組學(xué)是指微生物群落不依賴于培養(yǎng)的分析方法，包括宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)、宏代謝組學(xué)技術(shù)等組學(xué)研究[2]。宏基因組學(xué)通過提取特定環(huán)境（胃腸道、土壤、海洋、污水等）微生物總DNA，進(jìn)行分析得出環(huán)境中微生物多樣性及分子生物學(xué)信息。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)從微生物總RNA水平上研究復(fù)雜微生物活動(dòng)狀態(tài)，反映所形成蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量、修飾以及發(fā)揮功能的位置或區(qū)域等，其發(fā)揮功能作用還需要用宏蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。（宏）蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以分析剪接變體和共翻譯和翻譯后修飾，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)復(fù)合物的檢測(cè)[3]。宏代謝組學(xué)通過確定代謝產(chǎn)物被釋放到環(huán)境中來完成功能網(wǎng)絡(luò)圖譜。宏組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合起來分析能進(jìn)一步揭示特定環(huán)境微生物功能、代謝活動(dòng)之間的聯(lián)系。

2 宏組學(xué)在瘤胃微生物中的應(yīng)用

2.1 宏基因組學(xué)在瘤胃微生物中應(yīng)用 宏基因組學(xué)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新穎微生物研究方法[4]。與其他關(guān)于瘤胃微生物群的研究一樣，宏基因組學(xué)被用來更好地分析微生物與淀粉酶解、纖維降解、甲烷排放的關(guān)系。

瘤胃微生物是反芻動(dòng)物進(jìn)行飼草料降解的重要部分。宏基因組學(xué)最初的研究是確定反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的微生物主要種類及優(yōu)勢(shì)菌群。不同反芻動(dòng)物在門水平瘤胃微生物優(yōu)勢(shì)菌群不同[5-12]（表1），其中大部分是硬壁菌門、擬桿菌門、變形菌門。而對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫中所有瘤胃來源的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，也表明瘤胃中大部分細(xì)菌屬于厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[13]。厚壁菌門是分解纖維的主要菌門，含有大量的降解纖維素的菌屬[14]。

基于宏基因組學(xué)方法能夠分析出大量瘤胃微生物功能性基因，在首次進(jìn)行瘤胃微生物宏基因組學(xué)深度測(cè)序中，Brulc等[15]發(fā)現(xiàn)了糖苷水解酶和纖維素功能基因。在這之后對(duì)瘤胃微生物功能性酶基因的篩選得到了廣泛研究。在海子水牛瘤胃微生物功能基因研究中發(fā)現(xiàn)，有38 011個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)具有木質(zhì)纖維素降解酶活性，其中歸屬于GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因較多[16]；在駱駝瘤胃微生物發(fā)現(xiàn)1種新的耐熱木聚糖酶基因（PersiXyn1），在pH 8和40℃下酶活性保持在80%以上[17]。同時(shí)瘤胃宏基因組學(xué)分析能夠得到較多未被開發(fā)的微生物酶源。在駱駝瘤胃中對(duì)附著植物纖維上的微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)木質(zhì)纖維素降解和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）發(fā)酵的關(guān)鍵物種，表明駱駝瘤胃的微生物群是一種密度很大，仍未被開發(fā)的微生物酶源[18]。對(duì)溫室氣體甲烷排放進(jìn)行研究，通過分析宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了甲烷生成基因mcrA和fmdB與甲烷排放相關(guān)[19]。瘤胃微生物宏基因組數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中微生物物種和功能進(jìn)行對(duì)比，將是尋找用于工業(yè)相關(guān)領(lǐng)域功能性酶基因重要來源之一。

2.2 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在瘤胃微生物中應(yīng)用 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究一定時(shí)間和空間下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的所有RNA，從轉(zhuǎn)錄水平上分析特定時(shí)期群體生命體的全部基因組轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。相比宏基因組學(xué)，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠在表達(dá)水平反映瘤胃微生物種類、多樣性和潛在基因功能。Li等[20]應(yīng)用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析表明，RNA水平上的個(gè)體間功能變異高于DNA水平。運(yùn)用宏轉(zhuǎn)錄組方法對(duì)麝牛瘤胃微生物總mRNA進(jìn)行測(cè)序分析，編碼序列與KOG、CAZy以及COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定出1 000個(gè)植物細(xì)胞壁降解酶，發(fā)現(xiàn)了893個(gè)碳水化合物活性酶，而在宏基因組的測(cè)序序列中只發(fā)現(xiàn)了103個(gè)碳水化合物活性酶[21]，表明宏轉(zhuǎn)錄組在微生物活性酶發(fā)現(xiàn)上優(yōu)于宏基因組，能夠發(fā)現(xiàn)更多纖維降解微生物種類及家族基因。在奶牛瘤胃微生物宏轉(zhuǎn)錄組研究中，發(fā)現(xiàn)糖苷水解酶（GH）家族基因在瘤胃碳水化合物降解中起主要作用，并強(qiáng)調(diào)了真菌和纖毛原生動(dòng)物對(duì)多糖降解的重要貢獻(xiàn)[22]。在飼喂玉米秸稈后特定時(shí)間下進(jìn)行瘤胃微生物宏轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)纖維素、半纖維素、寡糖降解過程起主要作用的微生物種類，其中瘤胃球菌屬、纖維桿菌屬和普氏菌屬是主要的植物細(xì)胞壁多糖降解菌，瘤胃厭氧真菌中的新美鞭菌屬、梨囊鞭菌屬、根囊鞭菌屬和纖毛原蟲中的前毛蟲屬、多甲多泡毛蟲屬在纖維素和半纖維素降解過程中也發(fā)揮著重要作用[23]。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏基因組學(xué)雖能發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物的功能作用，但瘤胃內(nèi)微生物的休眠和凋亡等活動(dòng)都會(huì)使測(cè)序結(jié)果與實(shí)際情況關(guān)聯(lián)分析出現(xiàn)偏差，這種偏差則需要通過其他組學(xué)共同進(jìn)行矯正。

2.3 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在瘤胃微生物中應(yīng)用 宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析是在給定的時(shí)間點(diǎn)描述瘤胃微生物群落的基因表達(dá)蛋白情況。與宏基因組相比，宏蛋白質(zhì)組在揭示反芻動(dòng)物飼料利用效率所涉及的關(guān)鍵酶的作用方面更具優(yōu)勢(shì)。在瘤胃微生物蛋白質(zhì)早期研究中，通過富集步驟識(shí)別纖維素結(jié)合蛋白，分析得到纖維素酶、琥珀酸桿菌、馬氏梭菌的外生葡聚糖酶[24]。隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，高性能的MS平臺(tái)使用，提供了更先進(jìn)和更有針對(duì)性的蛋白質(zhì)組測(cè)量及高級(jí)宏蛋白質(zhì)組分析[25]。在一項(xiàng)基于2D SDS-PAGE技術(shù)研究表明，通過液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定飼喂高濃縮飼料奶牛中瘤胃消化產(chǎn)物蛋白質(zhì)，揭示了原核生物蛋白質(zhì)組主要是參與糖酵解的酶，例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶，其中酶主要來自厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌（Bacteroidetes phyla）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷古菌的酶是最容易識(shí)別的蛋白質(zhì)之一，表明宏蛋白質(zhì)組學(xué)在探索反芻動(dòng)物低排放表型方面發(fā)揮作用[26]。在一項(xiàng)更詳細(xì)的瘤胃微生物宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通過對(duì)8 163種定量細(xì)菌蛋白的分析，發(fā)現(xiàn)有166種不同豐度的碳水化合物活性酶，并且大多數(shù)表達(dá)的糖苷水解酶屬于57家族和2家族，另外發(fā)現(xiàn)在富含纖維的飲食中，與丁酸酯形成相關(guān)的蛋白質(zhì)比例很高[27]。與宏轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相比，宏蛋白質(zhì)組能夠反映環(huán)境活性微生物的表達(dá)。通過對(duì)宏蛋白質(zhì)組學(xué)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)預(yù)測(cè)的蛋白功能比對(duì)分析中，發(fā)現(xiàn)在這些表達(dá)的基因中，有71%數(shù)據(jù)與宏蛋白組相匹配，其中延伸因子Tu、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸甘油酸激酶與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的匹配最為豐富[28]。形成差異的原因可能是實(shí)驗(yàn)技術(shù)未能覆蓋到所有微生物，但隨著生物信息學(xué)和技術(shù)進(jìn)步樣品的覆蓋率將會(huì)得到顯著提高。

表1 瘤胃微生物細(xì)菌主要菌群

2.4 宏代謝組學(xué)在瘤胃微生物中應(yīng)用 宏代謝組學(xué)是對(duì)微生物群落產(chǎn)生的代謝物的系統(tǒng)分析。宏代謝組學(xué)常使用核磁共振、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用、質(zhì)譜方法和分離技術(shù)來分析存在的代謝物，在瘤胃微生物代謝組研究中使用質(zhì)譜法和液相色譜法是目前應(yīng)用最廣泛方法，并且由于瘤胃代謝產(chǎn)物的多樣性，可能需要多個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定。Saleem等[29-30]和Ametaj等[31]利用各種方法及實(shí)驗(yàn)平臺(tái)檢測(cè)200多種瘤胃代謝物，包括磷脂、無機(jī)離子、氣體、氨基酸、短鏈脂肪酸和碳水化合物等，并結(jié)合其他文獻(xiàn)提供的87個(gè)代謝相關(guān)數(shù)據(jù)建立瘤胃液代謝物數(shù)據(jù)庫，包括246種被確認(rèn)和量化的瘤胃代謝物或代謝物種（對(duì)應(yīng)334種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)）。瘤胃代謝產(chǎn)物在飼喂不同比例日糧中很容易被區(qū)分。Zhao等[32]通過檢測(cè)大量與氮代謝有關(guān)的代謝產(chǎn)物，得出代謝物高度依賴于飲食組成，氨基酸代謝物和甲基胺（作為甲基化甲烷生成的底物）有顯著差異。在關(guān)于顆粒飼料影響瘤胃上皮代謝物的研究中，發(fā)現(xiàn)顆粒飼料明顯增加瘤胃上皮中8種代謝物的水平，降低了瘤胃上皮組織中7種代謝物的濃度[33]。因此，要深入了解瘤胃微生物代謝物質(zhì)的產(chǎn)生及如何影響宿主的生理生化變化，宏代謝組學(xué)單獨(dú)應(yīng)用并不能解決其問題。

3 宏組學(xué)聯(lián)合在瘤胃微生物中應(yīng)用

目前在瘤胃微生物研究中應(yīng)用宏組學(xué)聯(lián)合分析還處于起步階段，其中Li等[20]對(duì)比宏基因和宏轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，分析3個(gè)品種牛的瘤胃微生物功能活動(dòng)與飼料利用效率聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)高、低飼料效率牛的瘤胃微生物特征（如分類群、多樣性指數(shù)、功能類別和基因）差異很大，其中飼料利用效率高的牛瘤胃微生物多樣性低于飼料利用效率低的牛，并推測(cè)其原因是飼料利用效率高的牛瘤胃微生物產(chǎn)生的代謝物范圍較小，產(chǎn)出用于宿主利用的代謝物質(zhì)數(shù)量增多，可滿足動(dòng)物的能量需求；而飼料利用效率低的牛瘤胃微生物則相反，并且飼料利用效率低的牛瘤胃微生物可能具有較高的氮代謝，產(chǎn)生更多甲烷氣體，造成能量損失。Shabat等[34]結(jié)合宏基因組和代謝組數(shù)據(jù)對(duì)瘤胃微生物群進(jìn)行了組成、微生物活性和代謝物分析，表明較低豐富度的微生物體基因含量和分類群與較高的飼料效率密切相關(guān)，并且微生物群中微生物的特定富集和代謝途徑使動(dòng)物獲得了更好的能量和碳通道，同時(shí)減少了甲烷向大氣的排放，并與Li等[20]推測(cè)相同。

在結(jié)合3種組學(xué)數(shù)據(jù)分析中，Deusch等[27]將宏基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合分析，揭示了普雷沃氏菌科是一個(gè)代謝功能廣泛的群體，在濃縮和富含纖維的飼料消化中占據(jù)主導(dǎo)地位，并且代謝組學(xué)提供了有關(guān)瘤胃微生物代謝活動(dòng)的詳細(xì)信息。這項(xiàng)研究為深入了解細(xì)菌相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，以及對(duì)各種底物的適應(yīng)提供了更深入的見解。在應(yīng)用宏組學(xué)方法分析飼糧添加劑對(duì)瘤胃微生物的影響中，Ogunade等[35]通過對(duì)16S rRNA測(cè)序和代謝組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)酵母補(bǔ)充劑增加了8個(gè)纖維分解細(xì)菌屬、Anaerovorax和Lachnospiraceae豐度，活酵母補(bǔ)充增加了乙二醇環(huán)己二酮二縮酮和吡喃葡萄糖苷的濃度，并降低了蘇阿糖酸、黃嘌呤核苷、脫氧膽酸、月桂酰肉堿、甲氧基苯甲酸和十五烷基苯甲酸的濃度；bacteroidales BS11，Christensenellaceae R-7和Candidatus saccharimonas與氨基酸生物合成和能量代謝相關(guān)代謝物呈正相關(guān)。而Belanche等[36]通過體外瘤胃模擬技術(shù)，結(jié)合宏基因和代謝組學(xué)揭示了飼草保存方法和添加維生素E對(duì)瘤胃微生物群功能和代謝產(chǎn)物的影響，實(shí)驗(yàn)表明干草日糧可增加細(xì)菌多樣性指數(shù)。相反，維生素E的補(bǔ)充降低了多樣性指數(shù)；同時(shí)干草日糧的產(chǎn)甲烷菌多樣性高于青草日糧，但均勻度沒有表現(xiàn)出甲烷菌種類數(shù)量的減少；添加維生素E能提高瘤胃發(fā)酵的TVFA和產(chǎn)氣量，當(dāng)提供乙酸α-生育酚與α-生育酚時(shí)原生動(dòng)物活性較高。以上宏組學(xué)聯(lián)合分析中，雖提供了微生物與日糧、代謝物之間關(guān)系分析方法，但并不能對(duì)某種微生物代謝情況進(jìn)行全面揭示，需要在今后研究中結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)來揭示其功能特征，從系統(tǒng)層面理解瘤胃微生物代謝情況。

4 宏組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件

宏組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)探究微生物基因功能全面性及深度有重要影響，組學(xué)數(shù)據(jù)擁有較高的數(shù)據(jù)量，并且測(cè)序深度和覆蓋范圍也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，合理運(yùn)用軟件處理大量的組學(xué)數(shù)據(jù)是大部分研究人員關(guān)心的問題。目前有較多軟件用于組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，在代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析中，沃特世推出了LC-MS生物信息學(xué)產(chǎn)品Progenesis QI組學(xué)分析軟件，此軟件能夠精確地定量分析和鑒定，并發(fā)現(xiàn)樣品中的相關(guān)生物標(biāo)記物[37]。在分析比較代謝組數(shù)據(jù)軟件研究中，梁丹丹等[38]總結(jié)了13種功能軟件基本信息，并著重介紹和對(duì)比4種具有代表性軟件用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析，包括MAVEN、MZmine、MetaboAnalyst和XCMS Online軟件。而在宏基因組數(shù)據(jù)比較分析中，第一種被命名為XIPE-TOTEC的工具提供了2個(gè)樣本測(cè)試，并以宏基因鳥槍法序列作為輸入[39]。對(duì)環(huán)境微生物數(shù)據(jù)分類上，Huson等[40]對(duì)Megan進(jìn)行重寫和擴(kuò)展，增強(qiáng)了對(duì)大型微生物群數(shù)據(jù)集的分類和功能內(nèi)容進(jìn)行交互分析。由于宏組學(xué)產(chǎn)生的較多數(shù)據(jù)信息，數(shù)據(jù)的產(chǎn)生速度遠(yuǎn)高于分析軟件的發(fā)展速度，產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)未能得到充分分析。因此需要能夠處理整合宏組學(xué)分析的工具。目前，F(xiàn)ANTOM和MetaComp軟件具有綜合分析形式。FANTOM軟件能夠加強(qiáng)2組宏基因組樣本之間的比較能力，同時(shí)，允許探索性和比較分析宏基因組學(xué)豐度數(shù)據(jù)，重要的是，F(xiàn)ANTOM可以使用任何層次數(shù)據(jù)庫，它提供了NCBI分類層次結(jié)構(gòu)，以及KO、COG、PFAM和TIGRFAM數(shù)據(jù)庫[41]。MetaComp的圖形綜合分析軟件，可對(duì)宏基因組學(xué)和其他組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)、雙樣本、多樣本的假設(shè)檢驗(yàn)等分析，并對(duì)環(huán)境因素進(jìn)行新的函數(shù)回歸分析[42]。宏組學(xué)綜合分析是組學(xué)研究的前沿，目前環(huán)境微生物宏組學(xué)的綜合分析還未形成統(tǒng)一分析方式，需要相關(guān)研究人員不斷探索，為描述微生物之間的關(guān)系提供幫助。

5 展 望

反芻動(dòng)物瘤胃微生物具有復(fù)雜性、多樣性等特點(diǎn)，對(duì)瘤胃微生物群落、功能、代謝途徑等研究應(yīng)用宏組學(xué)聯(lián)合分析具有顯著優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，應(yīng)將宏組學(xué)與其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，全面分析微生物功能作用，用以找尋微生物-代謝物-宿主之間聯(lián)系的橋梁及分子途徑，并對(duì)其微生物代謝途徑進(jìn)行干預(yù)。隨著高通量測(cè)序成本逐漸降低，通過宏組學(xué)技術(shù)探究反芻動(dòng)物瘤胃微生物優(yōu)勢(shì)菌群、微生物功能的研究勢(shì)必會(huì)成為主要方向，并向各器官組學(xué)、血液和牛奶代謝組學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)等方向發(fā)展，其內(nèi)部生理代謝途徑和方式將得到解釋，從而更好地揭示日糧、環(huán)境、基因、疾病等對(duì)宿主影響。