LncRNA UNC5B-AS1對肺癌細(xì)胞黏附、侵襲及遷移的影響及其機制*

譚建軍， 隆姝孜， 張 濤△

(1. 重慶三峽中心醫(yī)院腫瘤科， 重慶 404000； 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科， 重慶 404000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，且呈逐年上升的趨勢[1]。由于肺癌是一種多基因疾病，所以肺癌發(fā)生過程中涉及的生物學(xué)過程很復(fù)雜[2]。因此，詳細(xì)了解肺癌發(fā)生和進展的機制和分子途徑對于改善肺癌患者的診斷和治療至關(guān)重要。長的非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄物。近年來，lncRNA作為潛在的生物調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲和遷移等細(xì)胞活動而備受研究者關(guān)注[3]。lncRNA的作用機制多種多樣，包括作為與微小RNA(microRNA，miRNA)相似的競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)海綿分子，參與基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與基因表觀遺傳調(diào)控等。越來越多的研究表明，lncRNA在肺癌的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮作用[4]。王亞芳等人[5]利用高通量測序分析了3例發(fā)生轉(zhuǎn)移及未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌組織中l(wèi)ncRNA表達譜的變化，結(jié)果顯示lncRNA UNC5B-AS1在轉(zhuǎn)移的肺癌組織中表達上調(diào)，提示其可能與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而，UNC5B-AS1對肺癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移的影響及可能的機制仍有待闡明。最近，據(jù)報道，miR-218-5p在許多人類癌癥中起著抑癌作用，如肺癌、肝細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌[6-8]。本實驗前期通過生物信息學(xué)手段預(yù)測發(fā)現(xiàn)，UNC5B-AS1和miR-218-5p之間存在特異性堿基互補結(jié)合位點，提示二者可能存在靶向關(guān)系。本研究首先檢測了UNC5B-AS1在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達情況，且過表達UNC5B-AS1可抑制肺癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移能力，并可作為miR-218-5p的分子海綿。這些研究將有助于闡明UNC5B-AS1在肺癌進展中的作用及其作為治療靶點的潛力。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本、細(xì)胞系和主要試劑

收集重慶三峽中心醫(yī)院腫瘤科2017年6月至2019年6月行手術(shù)切除的20例肺癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，資料完整且經(jīng)病理學(xué)確診為肺癌。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)重慶三峽中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。人支氣管上皮細(xì)胞系HBE和不同肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1437、H1975、H1299和H460均從中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所獲得。DMEM培養(yǎng)基從美國Biological Industries公司獲得；胎牛血清和青-鏈霉素雙抗從美國Gibco公司獲得；胰蛋白酶從美國Abcam公司獲得；UNC5B-AS1 siRNA及非特異性siRNA由上海吉凱制藥技術(shù)有限公司合成提供；miR-218-5p mimics和mimics對照購于廣州市銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑從日本TaKaRa公司獲得；Trizol試劑從北京康為世紀(jì)生物科技有限公司獲得；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從大連寶生物工程有限公司獲得；SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒從賽默飛世爾科技有限公司獲得；Transwell小室從美國Coring公司獲得；Matrigel基質(zhì)膠從美國BD公司獲得；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒從美國Promega公司獲得；UNC5B-AS1-Wt和UNC5B-AS1-Mut熒光素酶報告基因重組載體由上海吉瑪基因有限公司完成；Western blotting檢測相關(guān)試劑從上海碧云天生物技術(shù)研究所獲得；E-cadherin、Vimentin、Twist抗體及二抗從美國CST公司獲得。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HBE、A549、H1437、H1975、H1299和H460細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，接種密度為1×105cells/ml，在體積分?jǐn)?shù)為CO2、飽和濕度、37℃恒溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，待生長匯合度達90%以上時使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照1∶3或1∶4的比例進行傳代。取對數(shù)增殖期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞以胰酶消化，取2 ml細(xì)胞懸液接種到6孔板中，接種密度為1×105cells/ml，放置在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達50%左右時進行轉(zhuǎn)染，參照LipofectamineTM2000制造商說明書將UNC5B-AS1 siRNA及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，其中將轉(zhuǎn)染UNC5B-AS1 siRNA的A549細(xì)胞記為si-UNC5B-AS1組，將轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的A549細(xì)胞記為si-NC組，將未行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞記為Ctrl組。每組設(shè)置9個復(fù)孔，各組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 qRT-PCR檢測UNC5B-AS1和miR-218-5p的表達

收集肺癌組織和對應(yīng)癌旁組織，對數(shù)期HBE、A549、H1437、H1975、H1299和H460細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染48 h各組A549細(xì)胞，采用Trizol一步法分別提取組織和細(xì)胞中的總RNA。隨后采用超微量核酸檢測儀NanoDrop檢測RNA的純度和濃度。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備第一鏈cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒行qRT-PCR檢測。引物序列：UNC5B-AS1正向引物：5’-GATCCTGCCTCAGGGAAA-3’；反向引物5’-GCTCAAGAGGTTGGGACT-3’。GADPH正向引物5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’；反向引物5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’。miR-218-5p正向引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACACATGGT-3’；反向引物5’-GGGGGTTGTGCTTGATCTAAC-3’。U6正向引物5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC-3’；反向引物5’-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3’。建立20 μl反應(yīng)體系：cDNA 2 μl、SYBR Green Mix 10 μl、正反向引物各1 μl、ddH2O補足20 μl。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)為：95℃ 5 min，隨后設(shè)40個循環(huán)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s。所得實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt公式進行計算。以GADPH為內(nèi)參，計算UNC5B-AS1相對表達量，以U6為內(nèi)參，計算miR-218-5p相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 細(xì)胞黏附實驗

以無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取適量稀釋過的Matrigel膠鋪96孔板，于超凈工作臺中過夜風(fēng)干，備用。對數(shù)期的A549細(xì)胞以1×103cells/well接種到96孔板中，按照上述1.3方法分組和轉(zhuǎn)染，48 h后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液。取100 μl單細(xì)胞懸液(約1×104cells)加入到鋪膠的96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，放置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，取出96孔板，吸取培養(yǎng)液，以PBS洗滌3次，以甲醇固定10 min，吉姆薩染色15 min，以清水洗去染液，在200倍顯微鏡下觀察并計數(shù)細(xì)胞黏附數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.6 細(xì)胞Transwell侵襲實驗

各組A549細(xì)胞以胰酶消化，接種在Matrigel膠包被的Transwell小室24孔板中，在小室上室加入濃度為2×105cells/ml細(xì)胞懸液100 μl，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μl，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去上室微孔膜上的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，采用4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，用PBS洗滌小室，晾干，在100倍倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7 細(xì)胞劃痕愈合實驗

將轉(zhuǎn)染48 h后各組A549細(xì)胞用胰酶消化，將細(xì)胞以1×105cells/well平鋪于6孔板中，設(shè)3個平行復(fù)孔，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層匯合時，用無菌槍頭輕輕劃6孔板，保證劃線呈直線狀，用PBS洗去劃下的細(xì)胞。將6孔板放置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移距離。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

生物信息學(xué)在線軟件LncBase Experimental v.2預(yù)測表明，UNC5B-AS1與miR-218-5p存在相似結(jié)合位點，根據(jù)預(yù)測結(jié)果將miR-218-5p與UNC5B-AS1結(jié)合及突變位點的3’UTR分別擴增并構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體上，分別記為UNC5B-AS1-Wt和UNC5B-AS1-Mut(該步驟由上海吉凱制藥技術(shù)有限公司完成)，將UNC5B-AS1-Wt和UNC5B-AS1-Mut重組載體分別與miR-218-5p mimics或mimics對照共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，48 h后分別收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組A549細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參計算相對熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.9 Western blot

提取轉(zhuǎn)染48 h后各組A549細(xì)胞中總蛋白，BCA法對蛋白濃度進行測定，加入適量上樣緩沖液加熱變性蛋白。配制10% SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白加入上樣孔，電泳分離蛋白，采用半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜浸入5%脫脂奶粉封閉液中孵育2 h。根據(jù)抗體使用說明書用TBST 1∶1 000稀釋一抗，加入相應(yīng)一抗，冰上過夜雜交，加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫雜交2 h，以ECL發(fā)光顯影，在成像系統(tǒng)中曝光并獲取圖像，以GAPDH進行標(biāo)定，采用圖像分析軟件Quantity One分別計算各組A549細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和Twist蛋白相對表達水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 UNC5B-AS1在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，UNC5B-AS1在肺癌組織中的表達水平(3.04±0.55)明顯高于癌旁組織(1.21±0.32)(t=8.628，P<0.05)；UNC5B-AS1在肺癌細(xì)胞A549、H1437、H1975、H1299和H460中的表達分別為：(4.18±0.42)、(2.26±0.23)、(3.57±0.36)、(3.51±0.35)、(2.35±0.23)，顯著高于支氣管上皮細(xì)胞HBE(1.00±0.10)(P<0.05)，且UNC5B-AS1在A549細(xì)胞中的表達量最高(P< 0.05)，因此選取肺癌A549細(xì)胞用于后續(xù)研究。

2.2 UNC5B-AS1對A549細(xì)胞黏附能力的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細(xì)胞中UNC5B-AS1的表達水平明顯下降(P<0.05)，而Ctrl組中UNC5B-AS1的表達水平無明顯改變(P>0.05)。黏附實驗結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組細(xì)胞黏附數(shù)明顯減少(P<0.05)，而Ctrl組細(xì)胞黏附數(shù)無明顯改變(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of UNC5B-AS1 and cell adhesion numbers in A549 cells of each n=9)

2.3 UNC5B-AS1對A549細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，Ctrl組、si-NC組和si-UNC5B-AS1組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為：(126.24± 12.56)個、(128.07±14.08)個和(50.14±6.10)個，與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，而Ctrl組穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯改變(P>0.05，圖1)。

Fig. 1 Transwell test to detect the invasion ability of A549 cells in each group(×200)

2.4 UNC5B-AS1對A549細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，Ctrl組、si-NC組和si-UNC5B-AS1組細(xì)胞遷移距離分別為：(1.21±0.14)μm、(1.09±0.12)μm和(0.30±0.03)μm，與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細(xì)胞遷移距離明顯減小(P<0.05)，而Ctrl組細(xì)胞遷移距離無明顯改變(P>0.05，圖2)。

Fig. 2 Scratch healing test to detect the migration ability of A549 cells in each group

2.5 UNC5B-AS1和miR-218-5p靶向關(guān)系的驗證

生物信息學(xué)軟件LncBase Experimental v.2等預(yù)測結(jié)果顯示，UNC5B-AS1和miR-218-5p間存在特異性結(jié)合位點(圖3)，提示miR-218-5p可能是UNC5B-AS1的靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics和UNC5B-AS1-Wt重組熒光素酶載體，miR-218-5p能夠顯著抑制細(xì)胞相對熒光素酶活性(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics和UNC5B-AS1-Mut重組熒光素酶載體，miR-218-5p對細(xì)胞相對熒光素酶活性無明顯抑制作用(P>0.05，表2)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Ctrl組、si-NC組和si-UNC5B-AS1組細(xì)胞中miR-218-5p的表達水平分別為：(0.99±0.09)、 (0.97±0.09)和(0.36±0.04)，與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細(xì)胞中miR-218-5p的表達水平明顯降低(P<0.05)，而Ctrl組miR-218-5p的表達水平無明顯變化(P>0.05)。

Fig. 3 UNC5B-AS1 targeted miR-218-5p relationship verification

Tab. 2 Double luciferase reporter assay to detect the interaction between UNC5B-AS1 and miR-218-5p

2.6 UNC5B-AS1對A549細(xì)胞EMT過程的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)，Vimentin和Twist蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)，而Ctrl組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和Twist蛋白表達水平無明顯改變(P> 0.05，圖4，表3)。

Fig. 4 Western blot to detect the expression of E-cadherin, Vimentin and Twist in A549 cells of each group

Tab. 3 Comparison of E-cadherin, Vimentin and Twist protein expression levels in A549 cells in each n=9)

3 討論

肺癌相關(guān)死亡率是全球癌癥死亡的最常見原因。在所有肺癌病例中，已確診的患者中超過一半發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，且超過70%的肺癌患者被確診時已處晚期[9]。因此，迫切需要研究涉及肺癌的分子機制并獲得潛在的治療靶點。研究表明lncRNA與肺癌中的不同生物過程有關(guān)。例如，lncRNA SNHG1、lncRNA TUC338和lncRNA CCHE1均可通過調(diào)控不同信號通路參與肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[10-12]。但是，關(guān)于lncRNA在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用還遠(yuǎn)未明確。本項研究首次證明了UNC5B-AS1在肺癌組織和細(xì)胞系中表達上調(diào)。下調(diào)UNC5B-AS1可顯著抑制肺癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移。這些數(shù)據(jù)表明UNC5B-AS1可作為癌基因在肺癌的發(fā)展和進展中起關(guān)鍵作用。

UNC5B-AS1是UNC-5 netrin受體B(UNC-5 netrin receptor B，UNC5B)的轉(zhuǎn)錄反義RNA。UNC5B-AS1是相對新穎的lncRNA，但一些研究探索了UNC5B的功能。Kong等人研究顯示，UNC5B的過表達抑制膀胱癌5637細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯[13]。另一項研究顯示，在甲狀腺癌中l(wèi)ncRNA TNRC6C-AS1的下調(diào)通過上調(diào)miR-129-5p的表達來抑制UNC5B，從而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。UNC5B在腎癌、前列腺癌組織中呈低表達，通常作為抑癌基因發(fā)揮作用[15]。因此，UNC5B-AS1作為UNC5B的轉(zhuǎn)錄反義RNA在腫瘤進展中可能發(fā)揮癌基因的作用。最近一項研究顯示，上調(diào)的lncRNA UNC5B-AS1可作為潛在的致癌基因與甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和腫瘤組織學(xué)類型有關(guān)，更重要的是，UNC5B-AS1能夠促進乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲[16]。本實驗結(jié)果同樣顯示UNC5B-AS1在肺癌組織和細(xì)胞系中呈高表達，下調(diào)UNC5B-AS1的表達后，A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移能力均明顯受到抑制。表明UNC5B-AS1可能促進肺癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移，這與上述研究一致。

證據(jù)表明，lncRNA作為ceRNA通過選擇性吸附miRNA調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。在本實驗中雙熒光素酶報告基因檢測實驗證明了UNC5B-AS1直接與miR-218-5p結(jié)合。且qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，UNC5B-AS1能夠負(fù)向調(diào)控miR-218-5p的表達。miR-218-5p被證明是多種癌癥(包括肺癌)中的腫瘤抑制因子。例如，Zhu等人證明了miR-218-5p可通過與EGFR結(jié)合在抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移中起關(guān)鍵作用[18]。miR-218-5p直接負(fù)向調(diào)節(jié)白喉酰胺生物合成1(DPH1)的表達抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力和侵襲能力[19]。此外，miR-218-5p在妊娠期高血壓患者血清中表達減少，且能夠抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移[20]。因此本實驗數(shù)據(jù)首次表明UNC5B-AS1負(fù)向調(diào)控miR-218-5p的表達促進肺癌A549細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移。目前普遍認(rèn)為，EMT與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移密切相關(guān)[21]。EMT表現(xiàn)為細(xì)胞間黏附能力喪失，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，使細(xì)胞獲得運動力及遷移能力。本實驗通過Western blotting檢測A549細(xì)胞中維持上皮細(xì)胞特性的分子E-cadherin以及間充質(zhì)標(biāo)志分子Vimentin和Twist的表達情況，結(jié)果顯示，下調(diào)UNC5B-AS1能夠抑制E-cadherin的表達，并促進Vimentin和Twist的表達。提示UNC5B-AS1對肺癌A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移能力的調(diào)控作用是通過影響EMT的發(fā)生實現(xiàn)的。

綜上，本實驗結(jié)果顯示，lncRNA UNC5B-AS1在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達明顯升高，下調(diào)UNC5B-AS1可靶向調(diào)節(jié)miR-218-5p的表達、通過阻礙EMT來抑制肺癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移。本研究首次證明了lncRNA UNC5B-AS1和miR-218-5p的靶向關(guān)系，且證實UNC5B-AS1可靶向調(diào)控miR-218-5p的表達參與肺癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移?？傊?，本研究確定了UNC5B-AS1在肺癌中的致癌作用，提供了對肺癌發(fā)生的分子機制的進一步了解，為發(fā)現(xiàn)肺癌新型靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。