大鼠腦缺血/再灌注過程中血流量和腦組織含水量的變化趨勢*

張 冉, 馬夢堯, 蘇欣宇， 孟 想, 姜鯤鵬, 李 曙△， 洪 云

(1. 皖南醫(yī)學院病理生理學教研室， 安徽 蕪湖 241002； 2. 皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學科， 安徽 蕪湖 241001)

缺血性腦卒中(ischemia stroke)也稱腦梗死，是人類疾病的第二大死因[1-2]。在缺血性腦血管病治療中，多數(shù)常規(guī)治療手段都可引起缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CI/RI)。腦水腫作為腦缺血再灌后最嚴重的并發(fā)癥，也是引起腦功能障礙甚至死亡的主要原因之一。血管源性腦水腫是腦梗塞后最常見的一種，主要特點是腦微血管通透性增高，血腦屏障完整性被破壞[3]。目前，對腦水腫的發(fā)病機制研究主要有血腦屏障學說、腦微循環(huán)障礙學說等。因此，了解腦微循環(huán)的改變對腦水腫的影響對于尋找缺血/再灌注損傷的治療和康復(fù)措施也具有重要意義。有實驗表明，高血壓和腦血管梗塞多伴有血液動力學和血液流變學的異常[4]。目前，經(jīng)顱多普勒超聲技術(shù)已被廣泛用于檢測腦血液動力學與腦血液流變學的相關(guān)參數(shù)，這些參數(shù)在評價高血壓、高顱壓、阿爾茨海默病等腦血管及腦神經(jīng)性病變有重要意義，并且腦血液動力學指標與腦血管梗塞的病理性變化方面更密切相關(guān)[4-6]。相對于腦血液動力學與流變學那些復(fù)雜的指標而言，腦血流量變化是在腦缺血/再灌注過程中最直接的改變[5]。因此，腦血流量的檢測可做為腦血液動力學改變的直接參照。PeriCam PSI 血流灌注成像系統(tǒng)(簡稱PSI系統(tǒng))基于激光散斑對比分析技術(shù)，可對大面積組織進行實時的血流動態(tài)成像監(jiān)測，為微循環(huán)研究提供了全新的方法。本研究利用PSI系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)獲得全腦紅外線散斑圖、血流灌注量對比曲線和腦缺血/再灌注過程中的血流量數(shù)據(jù)變化[7-9]，結(jié)合干濕重法測定的腦組織重量，探討腦血流量變化與腦水腫形成的相關(guān)性，以期為臨床治療和促進康復(fù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇4～6周齡的SPF級SD雄性大鼠20只，體重240～260 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供[證書編號SCXK(湘)2014-0011]。自然光照飼養(yǎng)1周，正常飲食，維持室溫25℃，濕度60%～70%。

1.2 主要試劑、儀器和材料

10%的水合氯醛、冰生理鹽水、乙醚；PeriCam PSI血流灌注成像儀為德國Pari公司產(chǎn)品；0.1 mg精度的FA2004電子分析天平為天津天馬衡基有限公司產(chǎn)品；BHD-9101.0A型電熱恒溫古風干燥箱為金華市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；恒溫鼠板為成都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品；定性濾紙為杭州富陽北木漿紙有限公司產(chǎn)品；A5級栓線為北京西濃科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 MCAO大鼠模型制備

實驗前大鼠禁食8～10 h，不禁水。所有大鼠均參照改良Zea-Longa線栓法建立MCAO大鼠模型[10-12]，腹腔注射10%水合氯醛(0.3～0.5 ml/100 g)麻醉，待其全身肌肉松弛，呼吸、心跳平穩(wěn)后，將大鼠仰臥位固定于恒溫鼠板上。頸部常規(guī)備皮、消毒，做正中切口，頓性分離肌層，暴露右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動脈；夾閉頸總動脈，頸外動脈做一切口，線栓由此插入頸總動脈；游離頸外動脈，緩慢輕柔將線栓插入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段(此時應(yīng)注意避免進入翼額動脈)至線栓標記處，固定線栓，縫合皮膚。當患側(cè)血流灌注量下降超過50%即為線栓插入成功[13]。實驗分為正常組(缺血前)、缺血5 min、30 min、1 h、2 h組及再灌注1 h、2 h、4 h、6 h及24 h組。正常組麻醉后不做任何處理，缺血組按上述線栓法建立不同時間的缺血模型，再灌注組大鼠均缺血2 h后拔出線栓建立不同時間的再灌模型。

1.4 PSI監(jiān)測血流量變化情況

大鼠麻醉后，先測量未缺血時右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)血流量：將大鼠俯臥位固定于恒溫鼠板上，分離頭部皮膚、黏膜(較為敏感)，暴露大鼠顱骨；打開PSI系統(tǒng)，將大鼠移至系統(tǒng)檢測板上，固定頭部，保持俯臥位，維持呼吸、心跳平穩(wěn)，持續(xù)檢測15～30 s，縫合頭部皮膚，開始建立MCOA模型。持續(xù)監(jiān)測大鼠右側(cè)大腦在缺血5 min、30 min、1 h、2 h、再灌注5 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h及24 h的血流量變化，監(jiān)測過程用乙醚棉球在密閉環(huán)境中維持大鼠麻醉狀態(tài)，待呼吸、心跳平穩(wěn)后開始記錄。

1.5 干濕重法測定腦組織水含量

干濕重法是目前實驗室采用的測量腦組織水含量的經(jīng)典方法。大鼠斷頭取腦后，腦組織用冰生理鹽水沖洗干凈，除去延髓，置于冰上，用定性濾紙粘吸腦組織表面的水及血跡，沿大腦縱裂將其分成左、右腦半球，分別稱取兩側(cè)半球的重量，即為濕重；隨后將腦組織置于65℃恒溫烤箱中，24 h后取出，稱其重量即為干重[14-16]。參照Panahpour H[17-18]等的方法計算腦組織水含量及水腫形成。

水含量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100

水腫(%)=損傷側(cè)水含量-非損傷側(cè)水含量

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同時間點腦血流監(jiān)測成像結(jié)果的比較

圖像可清晰顯示缺血前大腦血流灌注量豐富，灌流通暢，正常血供區(qū)呈現(xiàn)紅色；缺血后，右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)出現(xiàn)血流中斷，血流量下降；缺血前期，血流量逐漸下降，缺血1 h后血流量下降至最低，缺血2 h時變化趨勢不明顯；再灌初期，血流量恢復(fù)較快，再灌30 min時下降，再灌中期變化趨勢不明顯，再灌4 h后緩緩上升，至再灌24 h血流量恢復(fù)到接近正常(圖1，見彩圖頁Ⅱ)。實驗結(jié)果說明大鼠腦中動脈栓塞時腦血流量會逐漸下降，恢復(fù)再灌的早期血流量立刻恢復(fù)，但前期突然下降，中后期緩慢上升接近正常值。

Fig.1 Color diagram shows cerebral blood perfusion at 12 different time points during the process from ischemia to reperfusion, where red represents the blood supply area and yellow represents the absence of blood flow. Comparing the areas enclosed by the oval box in the right hemisphere, the differences were obvious

2.2 不同時間點腦血流量變化百分比的比較

表中數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理，以缺血前血流量為1，不同時間點占缺血前血流量的比值為最終分析。線栓插入后，血流量即刻下降30%～40%；1 h下降50%(P<0.05)；2 h無明顯變化；再灌注時血流量即刻恢復(fù)至70%-80%(P<0.05)；30 min時下降至60%(P<0.05)；2 h血流量變化不明顯；4 h血流量開始上升接近70%(P<0.05)；6 h血流變化不明顯，至24 h再次上升至85%(P<0.05)，但任低于缺血前血流量。由此可以得出，大鼠在缺血2 h后血流達到最低，再灌后血流量即刻恢復(fù)，之后由于再灌注損傷的作用血流量出現(xiàn)了下降，再灌30 min～2 h之間血流量比較穩(wěn)定，但仍然高于灌注前；4 h接著上升至6 h相對穩(wěn)定，24 h再次上升接近缺血前水平(表1)。

Tab. 1 Comparison of the ratio of blood flow at different times to n=5)

2.3 不同時間點大鼠左、右腦半球水含量和水腫形成的比較

大鼠腦缺血/再灌注過程中左半球水含量在各時間點中無明顯差異。右半球水含量與Control組比，缺血2 h組無明顯變化，；再灌30 min、4 h及24 h組明顯上升(P<0.05),且再灌24 h組水含量較30 min和4 h組均顯著上升(P< 0.05)。同時，腦水腫程度與Control組比，缺血2 h和再灌30 min無明顯差異，再灌4 h和24 h組較正常組、缺血組及再灌30min組都明顯增高(P<0.05)且再灌24 h組較4 h組更顯著(P<0.05)。實驗結(jié)果說明大鼠大腦右半球水含量在缺血/再灌注過程中逐漸上升，并且腦水腫程度在再灌注中后期也逐漸加重(表2，圖2)。

Fig. 2 Brain tissue in wet and dry state

Tab. 2 The percentage of WC and edema formation in the left and right hemispheres of the brain tissues of rats in different groups(%， n=3)

3 討論

本研究利用PSI血流灌注儀連續(xù)監(jiān)測大鼠從缺血前到缺血2 h到再灌注24 h過程中缺血側(cè)大腦的血流量變化，結(jié)果表明，大鼠大腦缺血期間血流量逐漸下降，隨著再灌注的發(fā)生，再灌瞬間(5 min)血流量恢復(fù)較大，早期(30 min)緩慢下降至2 h期間維持穩(wěn)定；中期(4 h)開始上升保持穩(wěn)定，后期(24 h)再次上升接近缺血前。這說明大鼠大腦缺血/再灌注期間血流量的變化存在一定的規(guī)律性，尤其是在再灌30 min時血流量下降值得深入討論。經(jīng)過對不同時間點缺血及再灌模型的大鼠腦組織干濕重的測定，結(jié)果表明，各組樣本間左側(cè)腦半球無明顯水含量的改變；右側(cè)腦半球血流量在再灌早期下降后4 h開始上升，此時腦水腫形成也明顯增高；24 h時，腦血流量恢復(fù)到最大，而腦水腫形成最高。因此，我們認為大鼠大腦缺血/再灌注中后期腦血流量的變化是造成腦水腫的重要因素之一。

目前，對于腦缺血/再灌注損傷的研究大多集中在能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等相關(guān)機制上，在腦微循環(huán)障礙方面的研究鮮有報道。缺血后腦水腫形成的機制也還不是很清楚，主要涉及鈣離子學說、腦微循環(huán)障礙學說、血腦屏障學說及腦細胞代謝障礙等[19]。實驗已經(jīng)證實，腦缺血/再灌注后神經(jīng)元的損傷加重與ROS的含量增多有關(guān)。并且在缺血/再灌注大鼠的腦組織中，缺血側(cè)ROS的含量隨再灌時間的延長(3 h～24 h)而增加[20]。而本實驗的結(jié)果顯示，再灌后腦血流量增加的同時腦組織水含量也明顯增多。因此，我們認為再灌后增加的腦血流量也通過某種途徑影響了ROS的產(chǎn)生或清除障礙，這有待進一步的研究。臨床上腦水腫是缺血性腦卒中的嚴重并發(fā)癥，有研究表明[3]，CART肽(內(nèi)源性活性肽)可抑制腦缺血引起的血腦屏障通透性增高而減輕腦水腫。也有文獻表明，在中風期間增強微血管循環(huán)也可具有神經(jīng)保護作用[21]。因此，有效減少腦水腫的發(fā)生也是目前臨床治療的重要手段。本實驗研究大鼠腦缺血/再灌后血流量的變化與腦水腫的相關(guān)性，希望可以給臨床治療提供新的思考方向。