川楝素對人胃癌細胞MKN-45中CTPS細胞蛇形成的影響及其機制*

陳 雯， 張偉偉,2△， 潘 陽， 劉 暢， 邵淑麗,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 齊齊哈爾 161006)

川楝素(toosendanin, TSN)是從楝屬植物樹皮中提取出來的一種三萜烯類物質(zhì)，研究證明，其通過誘導(dǎo)細胞分化以及細胞凋亡從而具有抗腫瘤作用[1]。在肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等癌細胞中，川楝素可誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡，以及對PI3K/Akt、MEK/Erk、MAPK/JNK通路的抑制[2, 3]。在對膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)的研究中表明，TSN通過雌激素受體(ER)依賴的機制選擇性地抑制U87和C6細胞的癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。在TSN誘導(dǎo)細胞凋亡過程中，細胞對核酸的需求量明顯減少，然而TSN與核酸合成的關(guān)系尚鮮有報道。

CTP合成酶(CTP synthase, CTPS)是生物體內(nèi)合成CTP途徑中的關(guān)鍵限速酶，在DNA、RNA的合成以及磷脂代謝過程中起著重要作用，對細胞增殖具有一定的影響[5]。在腫瘤細胞中，CTPsyn表達水平升高并且與細胞增殖能力增加有關(guān)[6]。當CTPS表達升高時其在細胞內(nèi)可以形成一種保守的無膜絲狀結(jié)構(gòu)，該絲狀結(jié)構(gòu)被命名為“細胞蛇”[7]。目前為止，研究表明有多種代謝酶均可形成細胞蛇結(jié)構(gòu)，例如從頭合成尿苷三磷酸(GTP)的限速酶肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)、乙酰輔酶A羧化酶等[8-10]。DON(6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸)是一種谷氨酰胺類似物，其可以有效地誘導(dǎo)CTPS形成細胞蛇結(jié)構(gòu)[8]。MPA(抑制劑霉酚酸)是一種廣泛使用的免疫抑制劑，其可以誘導(dǎo)IMPDH形成細胞蛇結(jié)構(gòu)[11, 12]。在人肝癌細胞中有CTPS細胞蛇的存在[13]。當TSN誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡時，核酸的需求量降低，CTPS是否會組裝成CTPS細胞蛇進而降低CTPS酶的活性尚不清楚。

原癌基因c-Myc(MYC)參與腫瘤發(fā)生中異常的核苷酸合成。已有研究證明，在多種癌細胞中MYC基因的表達水平均升高[14]。研究表明，在果蠅的卵泡細胞中MYC表達升高時誘導(dǎo)CTPsyn形成CTPS細胞蛇[6]；川楝素對胃癌細胞中MYC基因表達的影響尚不清楚，是否通過改變MYC基因的表達影響胃癌細胞中CTPS細胞蛇的形成尚鮮有報道。因此本實驗以人胃癌細胞MKN-45為研究對象，探討川楝素、MYC與胃癌細胞中CTPS細胞蛇之間的關(guān)系，以期為有效治療胃癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與抗體

人胃癌細胞MKN-45購于北納生物有限公司，CTPS一抗和二抗Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit-IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1. 2 主要試劑

川楝素購自北京索萊寶科技有限公司。DON、MPA購自Sigma公司。DAPI染液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。4%多聚甲醛、CCK-8試劑盒、抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物公司。胎牛血清購自Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

選用含有20 %胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MKN-45細胞。

1.4 誘導(dǎo)CTPS細胞蛇形成

配制1 mmol/L DON和1 mmol/L MPA分別作用MKN-45細胞6 h，然后利用免疫熒光對CTPS細胞蛇的形態(tài)進行檢測。

1.5 CTPS細胞蛇形成檢測

取對數(shù)生長期的MNK-45細胞，轉(zhuǎn)移至含有細胞爬片的孔板中，根據(jù)具體需要處理細胞一段時長后，吸去培養(yǎng)基，加入2 ml的PBS清洗細胞1～2次后棄液體，然后加入2 ml 4%-多聚甲醛4℃固定30 min。用PBST(PBS+曲拉通X-100)于4℃搖床清洗細胞3次，每次5 min；加入2 ml 封閉液(PBST+牛血清白蛋白)于室溫封閉1 h；加入10 μl CTPS一抗于濕盒中4℃孵育過夜。加入2 ml PBST清洗細胞，棄液體后加入10 μl二抗于室溫避光孵育1 h；沖洗細胞后加入50 μl DAPI染液室溫避光孵育3 min，沖洗細胞后將細胞爬片扣放在滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，避光保存。利用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察CTPS細胞蛇形態(tài)。

1.6 細胞增殖能力檢測

取對數(shù)生長期的MNK-45細胞，加入終濃度為0 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L的TSN，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。利用CCK-8試劑盒在酶標儀在波長為450 nm時的吸光度(D)值，通過公式：細胞存活率=[(實驗組平均D值-空白組平均D值)/(對照組平均D值-空白組平均D值)]×100%，計算得出細胞存活率。

1.7 qRT-PCR檢測MYC基因表達

取對數(shù)生長期的MNK-45細胞，加入終濃度為80 nmol/L的TSN分別作用細胞24 h、48 h、72 h；收集細胞提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系為25 μl Hotstart Fluo-PCR mix、21 μl ddH2O、2 μl cDNA和上下游引物各1 μl。MYC基因上游引物序列為：5’-GGG AGG CTA TTC TGC CCA TT-3’，下游引物序列為：5’-GCG GGA GGC TGG TTT TCC-3’；內(nèi)參基因β-actin上游引物序列為：5’-TCA CCC ACA CTG TGC CCC ATC TAC GA-3’，下游引物序列為：5’-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G -3’，采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MKN-45細胞中可形成CTPS細胞蛇

分別用DON 和MPA處理后細胞中CTPS可形成絲狀的細胞蛇結(jié)構(gòu)(圖1，單線箭頭所示)。此外還觀察到少量環(huán)狀或C狀CTPS細胞蛇(雙線箭頭所示)，CTPS細胞蛇可在細胞質(zhì)和細胞核中形成(三角箭頭所示，圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

Fig.1 The morphology of CTPS cytoophidia in MKN-45 cell（Scale bar=10 μm）

2.2 TSN對胃癌細胞生長及CTPS細胞蛇形成的影響

2.2.1 TSN對胃癌細胞生長的影響 TSN在濃度為20～100 nmol/L之間可顯著抑制 MKN-45細胞的生長。如表1所示，隨TSN藥物濃度的增加細胞增殖率呈下降趨勢，而且培養(yǎng)時間越長抑制效果越明顯，呈濃度一效應(yīng)依賴關(guān)系。

Tab. 1 The effects of TSN on the proliferation rate of MKN-45 cell (%, n=3)

2.2.2 TSN對CTPS細胞蛇形成的影響 分別利用終濃度為0 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L、120 nmol/L的TSN處理細胞72 h后，利用免疫熒光檢測然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察CTPS細胞蛇形成情況，結(jié)果如圖2所示。與對照組相比不同濃度的TSN均可誘導(dǎo)CTPS形成細胞蛇，其中濃度為80 nmol/L的TSN誘導(dǎo)形成的CTPS細胞蛇數(shù)量最多(圖2，見彩圖頁Ⅱ)。

Fig.2 The effects of TSN on the CTPS cytoophidia of MKN-45 cell（Scale bar=10 μm）

2.2.3 TSN處理不同時間對CTPS細胞蛇形成的影響 利用終濃度為80 nmol/L 的TSN分別處理細胞24 h、48 h、72 h；然后利用免疫熒光檢測然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)CTPS細胞蛇形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。隨時間的延長，細胞中的CTPS細胞蛇數(shù)量逐漸增加(圖3，見彩圖頁Ⅱ)。

Fig.3 The effects of 80 nmol/L TSN on the CTPS cytoophidia of MKN-45 cell（Scale bar=10 μm）

2.3 TSN對MYC基因表達的影響

80 nmol/L TSN作用細胞24 h后MYC基因mRNA相對表達量為0.350±0.023，與對照組相比MYC mRNA表達明顯降低(P<0.05)；作用細胞48 h后MYC基因mRNA相對表達量為1.647±0.068(P<0.05)，與對照組相比MYC mRNA表達明顯升高(P<0.01)；作用細胞72 h后MYC基因mRNA相對表達量為1.106±0.024(P<0.05)，與對照組相比MYC mRNA表達無明顯差異。

3 討論

目前，天然產(chǎn)物在抑制腫瘤細胞增殖方面取得了較為顯著研究進展，例如白扁豆多糖可抑制細胞增殖，并通過Bax-Bcl-2-caspase3 通路誘導(dǎo)人胃癌細胞發(fā)生凋亡[15]、楊芽黃素可通過影響TRAIL和PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡[16]、黃芩素可能通過抑制ERK-FAK信號通路抑制口腔鱗癌細胞的增殖以及侵襲[17]。川楝素(TSN)從楝屬植物根皮中提取的一種三萜化合物，具有殺蟲，鎮(zhèn)痛和抗炎的特性，此外，研究表明，TSN對癌細胞存活和增殖至關(guān)重要的多種途徑具有抑制作用[18, 19]。川楝素可促進肺癌細胞發(fā)生凋亡抑制細胞的增殖[20]，呈劑量與時間依賴性。本研究表明，TSN明顯抑制了MKN-45細胞的增殖，但川楝素影響細胞存活和增殖的機制尚不十分清楚。

細胞蛇代表了一種新型的細胞內(nèi)區(qū)室，其在生物中參與細胞代謝。細胞蛇第一個已知的組分是CTP合酶，該酶是以谷氨酸作為N源，將UTP和ATP從頭形成CTP的關(guān)鍵限速酶[5]。CTPS活性與某些疾病密切相關(guān)，例如在白血病、肝癌和結(jié)腸癌等癌細胞中CTPS活性明顯升高[10]。在果蠅癌癥模型中敲低CTPS可減少腫瘤形成，這表明CTPS在癌癥代謝中具有功能性作用[21]。在釀酒酵母細胞中CTPS聚合形成細胞蛇后增加CTPS的酶活性[22]。在體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞內(nèi)，當CTPS聚合形成細胞蛇時CTPS的催化活性被抑制[23]。本實驗結(jié)果表明，不同濃度的TSN可誘導(dǎo)CTPS形成細胞蛇，濃度為80 nmol/L的TSN處理組中細胞蛇形成效果最為顯著，而濃度為120 nmol/L的TSN處理組中細胞蛇數(shù)量明顯減少，其可能原因是TSN濃度過高導(dǎo)致細胞死亡明顯，存活的細胞較少從而影響細胞蛇的形成。為了進一步驗證最佳作用時間，本實驗利用濃度為80 nmol/L的TSN分別處理細胞24 h、48 h、72 h，實驗結(jié)果顯示，TSN作用72 h時細胞中細胞蛇數(shù)量明顯多于其余實驗組，但TSN誘導(dǎo)CTPS形成細胞蛇的可能機制尚不清楚。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子MYC(c-Myc)是癌基因和關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)節(jié)因子。c-Myc在許多不同腫瘤中表達上調(diào)，參與多達80%的人類癌癥[14]。同樣，CTPsyn水平在腫瘤細胞中經(jīng)常顯示為升高狀態(tài)，并且中國倉鼠腫瘤中CTPsyn基因座內(nèi)的聚集突變與增殖能力增加有關(guān)。已有研究表明，CTPS啟動子上具有MYC的結(jié)合位點[24]，而CTP syn表達水平影響著CTPS細胞蛇的形成。進一步研究表明，MYC表達量升高促進CTPS細胞蛇的組裝[6]。為了研究MYC在TSN誘導(dǎo)CTPS細胞蛇形成中的作用，本實驗檢測了TSN作用不同時間MYC mRNA的表達變化，結(jié)果表明TSN作用24 h其表達下降，可能是由于TSN作用初期細胞增殖被抑制而MYC又參與癌細胞的核酸合成，因此該基因的表達有所降低，此時CTPS細胞蛇的形成并不明顯。TSN作用48 h時細胞中CTPS細胞蛇的數(shù)量增多，同時MYC的表達升高，原因可能是MYC促進CTPS基因的表達進而加快CTPS細胞蛇的組裝。但當TSN作用72 h時MYC的表達升高恢復(fù)到原有水平，可能是由于CTPS細胞蛇數(shù)量達到一定程度并且細胞凋亡現(xiàn)象明顯，此時不需要MYC的輔助調(diào)節(jié)。

綜上所述，TSN抑制胃癌細胞增殖，其通過調(diào)節(jié)MYC基因的表達進而影響CTPS細胞蛇的形成。而CTPS細胞蛇在胃癌細胞增殖中的具體作用仍需進一步研究，可為癌癥治療提供新思路。