復(fù)合菌劑防治草莓根腐病的效果研究

王夢(mèng)園, 杜延全, 蔡威威, 王子浩*, 朱建強(qiáng)*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖北 荊州 434025; 2.中化農(nóng)業(yè)(臨沂)研發(fā)中心有限公司, 山東 臨沂 276000)

草莓在世界水果產(chǎn)業(yè)中具有重要地位。近年來(lái)，我國(guó)草莓種植面積擴(kuò)增，種植方式主要以日光溫室和塑料大棚為主，高濕和連作的特點(diǎn)使土傳病害成為草莓減產(chǎn)的重要因素，嚴(yán)重時(shí)幾乎絕產(chǎn)[1]。草莓根腐病是一種常見(jiàn)的土傳病害，其致病真菌多達(dá)20個(gè)屬，包括擬盤(pán)多毛孢菌屬(Pestalotiopsissp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、炭疽菌屬(Colletotrichumsp.)、絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)和疫霉菌屬(Phytophthorasp.)等[2-3]。由于致病菌的多樣性，且其發(fā)病癥狀具有滯后性，根部腐爛時(shí)再進(jìn)行防治效果不佳，增加了實(shí)際生產(chǎn)中的防治難度。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，各國(guó)對(duì)農(nóng)藥殘留問(wèn)題進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)和控制，采用常規(guī)化學(xué)藥劑進(jìn)行防治的方法已經(jīng)逐漸顯示出弊端[4]，生物防治因具有防治效果好、無(wú)污染、成本低、可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)點(diǎn)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。生防菌主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位、代謝抗菌物質(zhì)、拮抗作用和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式來(lái)抑制植物病原體，從而達(dá)到防治植物病害的效果[5]。相對(duì)于單一生防菌株，生防菌組合可功能互補(bǔ)，更好地避免環(huán)境適應(yīng)性差、局限性強(qiáng)、需活菌量大和防治效果不穩(wěn)定等問(wèn)題[6-9]，并且生防菌之間的相互作用能夠在提高防控植物病害效果的同時(shí)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[10-13]。

針對(duì)山東省臨沂市莒南縣草莓大棚常見(jiàn)的草莓根腐病，本研究從大量發(fā)病草莓植株根部分離出同一種病原菌——新棒狀擬盤(pán)多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)對(duì)峙方法初選拮抗菌，并采用盆栽和大田試驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)合菌株的抗病效果。目前關(guān)于N.clavispora引起草莓根腐病的防治研究尚未見(jiàn)報(bào)道，草莓根腐病的生物防治研究方面也只是單一菌株的研究與開(kāi)發(fā)[14-17]，而對(duì)于利用培養(yǎng)混合菌提高草莓根腐病生防效果的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)室內(nèi)與大棚試驗(yàn)結(jié)合的方式篩選出貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis-17)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefacen-27)和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis-Y1-7)進(jìn)行復(fù)配，考察復(fù)合菌對(duì)草莓根腐病的防治效果，以期為草莓根腐病生防菌資源的深入研究和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試草莓品種與菌株 供試草莓品種為甜查理(Sweet Charlie)和久香(Jiu Xiang)。選擇的目標(biāo)病原菌為新棒狀擬盤(pán)多毛孢(N.clavispora，分離于發(fā)病草莓植株根部)，其他病原菌有：茄腐鐮刀菌(Fusariumsolanum，分離于發(fā)病草莓植株根部)、草莓灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)、蘋(píng)果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)、黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonosporacubensis)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)均由中化農(nóng)業(yè)(臨沂)研發(fā)中心微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。3種拮抗微生物中，貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis-17，簡(jiǎn)記為“17#”)和解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefacen-27，簡(jiǎn)記為“27#”)分別分離于臨近發(fā)病區(qū)的健康草莓根系土壤，保存于中化農(nóng)業(yè)(臨沂)研發(fā)中心微生物實(shí)驗(yàn)室；枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis-Y1-7，簡(jiǎn)記為“Y1-7”)，由沈陽(yáng)化工研究院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基制作 制作培養(yǎng)基的試劑購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，用LDZX-75KBS型高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)于121 ℃高壓滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0～20.0 g、去離子水1 000 mL，pH 7.0。

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(1 000 mL)：酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、氯化鈉10.0 g，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基(1 000 mL)：酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂粉15.0 g，pH 7.0。

改良NA培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、牛肉膏3.0 g、酵母粉0.5 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂20.0 g，pH 7.0。

1.1.3溶液配制 配制試驗(yàn)溶液所用的化學(xué)試劑由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

Salkowski顯色液的配置：將1 mL 0.5 mol·L-1的FeCl3溶液加入到50 mL 35%的高氯酸中；CAS(chrome azurol sulphonate，鉻天青)檢測(cè)液的配置：①將0.07 g的CAS溶解于50 mL的去離子水中，再將1 mmol·L-1的FeCl3溶液加入10 mL，記為溶液A；②把0.06 g的HDTMA(hexadecyltri-methylammonium bromide，溴化十六碳烷基三甲胺)充分溶解于40 mL的超純水中，記為溶液B；③將A溶液沿著燒杯壁緩緩加入到B溶液中，二者混合均勻,即為CAS檢測(cè)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1拮抗菌株的拮抗性能及抑菌譜測(cè)定 菌株培養(yǎng)在GXZ-280C-LED型生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)中。采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法(五點(diǎn)法)分別測(cè)定生防菌株17#、27#和Y1-7對(duì)病原菌N.clavispora的拮抗能力。在25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d的草莓根腐病菌菌落邊緣用打孔器打取直徑為8 mm的菌餅，放置于新的PDA平皿(d=90 mm)中心，用接種針挑取活化于LB培養(yǎng)基中的生防菌單菌落點(diǎn)接于距平皿中心4 cm的4個(gè)角點(diǎn)上，以只接病原菌的平皿作為對(duì)照，25 ℃恒溫培養(yǎng)。待對(duì)照平皿內(nèi)的病原真菌長(zhǎng)滿整個(gè)平皿時(shí)，測(cè)量處理平皿的抑菌帶寬，每個(gè)處理5次重復(fù)。3株拮抗菌的抑菌譜測(cè)定則將病原菌分別換成茄腐鐮刀菌、草莓灰霉病菌、蘋(píng)果輪紋病菌、黃瓜霜霉病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌，采用平皿對(duì)峙法評(píng)價(jià)其抗病廣譜性。

1.2.2供試拮抗菌種間相互拮抗性試驗(yàn) 為了避免相互拮抗的菌株復(fù)配后相互干擾，抑制各自的防病或促生效果，將3株供試生防菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，恒溫水浴振蕩器中30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，取100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，待菌液干燥后，在平皿邊緣位置對(duì)稱放置無(wú)菌的濾紙片。在濾紙片上滴加10 μL其他待復(fù)配菌液，開(kāi)蓋待菌液干燥后，轉(zhuǎn)移平板至30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，以確定可以復(fù)配的菌劑組合。

1.2.3拮抗菌胞外粗提物對(duì)草莓根腐病菌Neopestalotiopsisclavispora的抑制作用 采用HCl沉淀法[18]對(duì)3株拮抗菌的拮抗物質(zhì)進(jìn)行提取：將3株拮抗菌活化后，按5%的比例接入液體LB培養(yǎng)基中(裝液量為三角瓶總?cè)萘康?%)，32 ℃、180 r·min-1搖床發(fā)酵培養(yǎng)20 h。待拮抗菌培養(yǎng)液培養(yǎng)結(jié)束后放入滅菌離心管中10 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，用6 mol·L-1的HCl調(diào)至上清液pH至2.0，放入4 ℃冰箱靜置過(guò)夜后取出，放入離心機(jī)中10 000 r·min-1離心20 min，去除上清液，向沉淀中緩慢加入pH 7.2的甲醇，用無(wú)菌棒攪動(dòng)直至沉淀被完全溶解，記錄消耗甲醇體積，3株拮抗菌的甲醇用量保持一致，在4 ℃的冰箱中放入8 h后取出10 000 r·min-1離心10 min，將上清液收集起來(lái)過(guò)0.22 μm的濾膜除菌，放入-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

拮抗菌胞外粗提取物的拮抗作用：用打孔器在25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d的草莓根腐病菌菌落邊緣打取直徑為8 mm的菌餅，放置于新的PDA平皿(d=90 mm)中心，在距病原菌中心3 cm處四周放置4個(gè)直徑為8 mm的無(wú)菌濾紙片。吸10 uL胞外粗提取物加至濾紙片上，從而對(duì)其拮抗效果進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置對(duì)照培養(yǎng)皿中無(wú)菌濾紙片上加pH 7.2的甲醇10 μL，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.4拮抗菌株促生物質(zhì)檢測(cè) ①吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA)檢測(cè)。將3株拮抗菌株接種于2 mL NA培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，然后將種子液轉(zhuǎn)入含有5 mmol·L-1色氨酸的NA培養(yǎng)液中，于30 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。然后于7 000 r·min-1離心20 min，收集上清液。于1 mL的上清液中，加入2 mL salkawski顯色劑，30 ℃顯色30 min，若有粉紅色產(chǎn)生，則說(shuō)明該菌株能產(chǎn)生IAA[19]，以不加菌的含有5 mmol·L-1色氨酸的NA培養(yǎng)液作為對(duì)照，重復(fù)3次。

②鐵載體(siderophores)檢測(cè)。采用Schwyn等[20]的方法對(duì)該菌株進(jìn)行鐵載體檢測(cè)。將2 mL CAS顯色液加入到2 mL無(wú)菌濾液中，室溫顯色，若顏色由青藍(lán)色變?yōu)辄S色，則說(shuō)明有鐵載體產(chǎn)生(在3 h內(nèi)無(wú)顏色變化說(shuō)明無(wú)鐵載體產(chǎn)生)，以不加菌的培養(yǎng)基作對(duì)照試驗(yàn)，重復(fù)3次。

1.2.5供試菌種對(duì)草莓根腐病Neopestalotiopsisclavispora的防治效果 為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn)，在土培條件下比較單菌落與復(fù)合菌落對(duì)草莓根腐病N.clavispora的防治效果及對(duì)草莓植株的促生效果。供試土壤為山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)地表土(≤10 cm)，土壤基本理化性狀指標(biāo)：pH 6.4、堿解氮12.21 mg·kg-1、有效磷42.24 mg·kg-1、速效鉀85.57 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)8.81 g·kg-1，121 ℃ 滅菌3 h。栽培所用的盆缽盆口直徑為28 cm、盆底直徑20 cm、盆高30 cm。選擇草莓品種為甜查理，選取生長(zhǎng)一致的匍匐莖幼苗，每盆栽種一株，待緩苗15 d后進(jìn)行生防菌防治效果驗(yàn)證盆栽實(shí)驗(yàn)。對(duì)幼苗進(jìn)行刀片傷根處理(傷根處理則為每株割斷兩根須根)，生防菌發(fā)酵液和病原菌孢子懸液均采用灌根方式。菌液濃度和接種時(shí)間見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置14個(gè)處理組，每組處理10株草莓苗，相當(dāng)于10次重復(fù)。每個(gè)處理統(tǒng)一管理，接菌10 d后開(kāi)始進(jìn)行病害觀察，及時(shí)做好記錄，30 d 后進(jìn)行病害統(tǒng)計(jì)及相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。生理指標(biāo)測(cè)定包括植株的株高和葉片面積。其中葉片面積檢測(cè)選擇草莓心葉外第三片葉子。草莓根腐病病情統(tǒng)計(jì)采用Vestberg等[21]的方法，分為6級(jí)：0級(jí)為整株正常；1級(jí)為根系發(fā)病率≤30%，葉片正常；2級(jí)為30%<根系發(fā)病率≤60%，葉片正常；3級(jí)為60%<根系發(fā)病率≤80%，葉片變黃；4級(jí)為根系發(fā)病率>80%，葉片枯萎；5級(jí)為整株死亡。

表1 不同拮抗菌對(duì)草莓根腐病Neopestalotiopsis clavispora防治的盆栽試驗(yàn)

病情指數(shù)=∑(病害的級(jí)別×該級(jí)別的植株數(shù))/(總株數(shù)×病害的最高級(jí)別)×100

防治效果=(對(duì)照發(fā)病指數(shù)-處理發(fā)病指數(shù))/對(duì)照發(fā)病指數(shù)×100%

1.2.6田間生防試驗(yàn) 試驗(yàn)在山東省臨沂市莒南縣草莓大棚進(jìn)行，分析不同菌劑對(duì)草莓植株的防病促生作用和對(duì)草莓果實(shí)產(chǎn)量的影響。試驗(yàn)共設(shè)置2個(gè)棚區(qū)(A棚和B棚)，這2個(gè)試驗(yàn)大棚已連作草莓6年，草莓根腐病發(fā)病率較高，供試病原菌N.clavispora分離自這2個(gè)試驗(yàn)大棚。A棚土壤pH 6.0，土壤堿解氮為139.84 mg·kg-1，有效磷為133.25 mg·kg-1，速效鉀為568.32 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為24.45 g·kg-1；B棚土壤pH 5.71，土壤堿解氮為158.89 mg·kg-1，有效磷為140.5 mg·kg-1，速效鉀為462.91 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為25.22 g·kg-1。2個(gè)試驗(yàn)棚內(nèi)各設(shè)有4個(gè)處理組(M1、M2、M3和M4)，1個(gè)對(duì)照組(CK)。M1處理為移栽前一周施用貝萊斯芽胞桿菌17#，M2處理為移栽前一周施用解淀粉芽胞桿菌27#，M3處理為移栽前一周施用枯草芽胞桿菌Y1-7，M4處理為移栽前一周施用復(fù)合菌劑(17#+27#+Y1-7)，對(duì)照CK為不加菌處理。試驗(yàn)組所施用菌劑有效活菌數(shù)含量為500億CFU·g-1，菌劑用量為6 kg·hm-2。4個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組各設(shè)6個(gè)小區(qū)，即每個(gè)處理6次重復(fù)。3壟為一個(gè)小區(qū)，A棚每個(gè)小區(qū)面積為7.6 m×3.0 m=22.8 m2，B棚每個(gè)小區(qū)面積為7.2 m×3.0 m=21.6 m2，小區(qū)之間空出1壟作為保護(hù)行。A棚種植草莓品種為久香，B棚種植品種為甜查理，栽種前統(tǒng)一施肥覆膜，后期統(tǒng)一管理。

在草莓生長(zhǎng)期內(nèi)2個(gè)棚分別隨機(jī)測(cè)產(chǎn)6次，病害調(diào)查于整個(gè)生長(zhǎng)期跟蹤記錄，統(tǒng)計(jì)方法參考1.2.5中的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。采用 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌對(duì)Neopestalotiopsis clavispora等病原菌的平板生長(zhǎng)抑制效果

從室內(nèi)平皿對(duì)峙結(jié)果(圖1)上看，拮抗菌株17#、27#和Y1-7對(duì)7種病原菌有不同程度的抑制作用。3株拮抗菌中，貝萊斯芽胞桿菌17#和解淀粉芽胞桿菌27#對(duì)各個(gè)供試病原菌的抑制程度差異不顯著。而枯草芽胞桿菌Y1-7對(duì)草莓灰霉病原菌的抑制作用小于17#和27#，對(duì)小麥赤霉病原菌的抑制作用大于17#和27#。此結(jié)果說(shuō)明，3株拮抗菌具有一定的廣譜抗病功能，且對(duì)灰霉病病原菌這種通過(guò)空氣、水等傳播的病害同樣有抑制作用，具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，農(nóng)戶可根據(jù)病原菌的傳播途徑進(jìn)行土施或噴施。由圖2可以看出，拮抗菌導(dǎo)致病原菌菌絲畸形，菌絲分支增多，菌絲彎曲、畸形，生長(zhǎng)停滯。初步判定供試生防菌對(duì)目標(biāo)病原菌有抑制作用。

圖1 拮抗菌對(duì)7種病原菌的抑制作用

圖2 病原菌絲形態(tài)鏡檢

2.2 供試拮抗菌種間相互拮抗性

由圖3可知，3株拮抗菌17#、27#和Y1-7互不拮抗，可以避免復(fù)合菌之間相互競(jìng)爭(zhēng)，相互抑制，影響其自身促生或抗病性這一問(wèn)題。

A：17#與27#、Y1-7的拮抗性；B：27#與Y1-7的拮抗性。

2.3 拮抗菌胞外粗提取物對(duì)病原菌Neopestalotiopsis clavispora的抑制作用

從圖4可以看出，利用HCl沉淀法能成功地從拮抗菌株發(fā)酵液中提取出抗病原真菌的活性物質(zhì)。由試驗(yàn)觀察得出，拮抗物質(zhì)粗提取物對(duì)病原菌N.clavispora的拮抗作用不會(huì)隨著時(shí)間的推移而減小，原因可能是抑菌物質(zhì)不易被病原菌分解，其結(jié)果驗(yàn)證了生防菌株的拮抗效果。從圖4還可以看出，相比于單株拮抗菌粗提取物的拮抗性，復(fù)合拮抗菌的粗提取物對(duì)病原菌N.clavispora的拮抗效果更好。

圖4 拮抗菌胞外粗提取物對(duì)病原菌Neopestalotiopsis clavispora的抑制作用

2.4 拮抗菌株促生物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

圖5顯示，向供試菌株的濾液中加入salkawski顯色劑后，顏色開(kāi)始時(shí)為淺黃色，而后逐漸顯粉紅色，說(shuō)明供試拮抗菌株均可產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)，而Y1-7產(chǎn)IAA的量高于其他菌株。向?yàn)V液中加入CAS顯色液后，室溫靜置1 h，供試拮抗菌株的濾液中產(chǎn)生絮狀沉淀且顏色發(fā)生改變，由藍(lán)綠色漸變?yōu)闇\黃色，而對(duì)照顏色無(wú)明顯變化，這說(shuō)明3株拮抗菌均能產(chǎn)生鐵載體，拮抗菌17#產(chǎn)鐵載體的量高于其他菌株。此結(jié)果為供試菌株可作為促生菌的開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

圖5 拮抗菌鐵載體和吲哚乙酸的顯色圖

2.5 供試菌種對(duì)草莓根腐病Neopestalotiopsis clavispora的防治效果

由表2可知，同一株生防菌在種植過(guò)程中對(duì)目標(biāo)病原菌N.clavispora的防治效果與接種時(shí)間有關(guān)，生防菌比病原菌早48 h接種可提高生防菌的防治效果8%～13%。本研究中，通過(guò)比較草莓植株的株高與葉面積，可知拮抗菌17#、27#和Y1-7具有一定的促生效果，印證了接抗菌促生物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果。所有處理中，防病抗病和促生效果最好的是復(fù)合拮抗菌處理，其防治效果高達(dá)73.68%，相比于無(wú)菌水處理和單一菌株處理，對(duì)草莓株高的促進(jìn)作用達(dá)到了極顯著水平。

表2 供試菌種對(duì)草莓植株抗病和生長(zhǎng)的影響

2.6 田間試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1供試菌種對(duì)田間草莓根腐病的防治效果

為了避免試驗(yàn)結(jié)果的偶然性，在2個(gè)不同的草莓大棚(A棚和B棚)中進(jìn)行菌株效果驗(yàn)證，由表3可知，5個(gè)處理中，相比于單一菌株，復(fù)合菌對(duì)田間草莓根腐病的防治效果最好，在A棚的防治效果達(dá)66.00%，在B棚的防治效果達(dá)57.18%，此結(jié)果與盆栽試驗(yàn)結(jié)果一致?？赡苁怯捎谔镩g土地環(huán)境的多變性，不可控因素多，土壤中存留的草莓根腐病病原菌多樣，導(dǎo)致田間防治效果達(dá)不到盆栽試驗(yàn)的防治效果。

表3 供試菌種對(duì)草莓根腐病的防治效果

2.6.2供試菌種對(duì)草莓產(chǎn)量的影響 對(duì)A棚和B棚2個(gè)草莓大棚6次隨機(jī)取樣的產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由表4結(jié)果可知，相比于不加菌處理和單一菌處理，復(fù)合菌處理的產(chǎn)量最高。A棚中復(fù)合菌處理相比于不加菌處理，每公頃產(chǎn)量增加了21.35%～37.99%；B棚中復(fù)合菌處理相比于不加菌處理，每公頃產(chǎn)量增加了12.97%～21.09%。產(chǎn)量的增加可能與病害的減少、植株存活率高有關(guān)。另外，由于復(fù)合菌的促生效果較單一菌株更好，健壯的植株開(kāi)花結(jié)果數(shù)高。所以產(chǎn)量更高，此結(jié)果驗(yàn)證了病害防治在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的必要性。

表4 供試菌種對(duì)草莓產(chǎn)量的影響

3 討論

本研究對(duì)供試生防菌的促生抗病物質(zhì)進(jìn)行了初探，利用盆栽和田間試驗(yàn)驗(yàn)證了供試菌組合對(duì)草莓植株的防病、促生和增產(chǎn)效果。首次報(bào)道了將枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌與貝萊斯芽胞桿菌組合應(yīng)用于防治N.clavispora所引發(fā)的草莓根腐病，并取得了良好防效。

N.clavispora除了引起草莓根部、葉片和果實(shí)病害，還能導(dǎo)致椰子、鱷梨、越橘、山核桃、藍(lán)莓、月季和菜豆樹(shù)等植株發(fā)病，對(duì)于N.clavispora的防治僅有化學(xué)藥劑防治相關(guān)報(bào)道[22-24]。近年來(lái)，為了避免造成環(huán)境污染和病原菌的抗藥性，利用有益微生物進(jìn)行病害防治成為較為理想的途徑之一[25]。生物防治中，具有環(huán)境相容性好、保存周期長(zhǎng)、對(duì)人畜安全、植物病原菌不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)的芽胞桿菌被廣泛運(yùn)用[26-27]，生防芽胞桿菌在防治多種植物真菌性病害中效果顯著[28-30]。Benizri等[31]研究指出，一些內(nèi)生芽胞桿菌(如枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌等)能夠在土壤和植物體內(nèi)穩(wěn)定定殖，具有產(chǎn)生促進(jìn)植株生長(zhǎng)和抗菌物質(zhì)的能力，防病抗病時(shí)效長(zhǎng)，克服了傳統(tǒng)生物防治田間應(yīng)用時(shí)效果不穩(wěn)定等問(wèn)題，具有良好的生防拓展?jié)摿Α２芫ЬУ萚32]在研究小麥黃花葉病的生物防治中發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌對(duì)小麥病害的預(yù)防作用顯著優(yōu)于治療作用，此結(jié)果與本研究的盆栽試驗(yàn)結(jié)果一致。戚家明等[33]基于全基因組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌BS-6基因組中存在7種芽胞桿菌屬重要或特有的次生代謝產(chǎn)物基因簇，4種未知功能的次生代謝產(chǎn)物基因簇，證明其具有良好的抑制真菌生長(zhǎng)的能力，此結(jié)論為本研究中供試生防菌的胞外粗提取物具有拮抗病原菌效果提供了理論基礎(chǔ)。劉雪嬌等[34]檢測(cè)到貝萊斯芽胞桿菌3A3-15的抑菌基因包括yndJ、srfAB、ituC、bamC和fenD，促生長(zhǎng)基因包括ysnE和dhbC，其分泌嗜鐵素能力較強(qiáng)，次生代謝物能導(dǎo)致病原菌(尖孢鐮刀菌)菌絲扭曲、膨大、畸形，對(duì)病原菌孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)，具有較好的生防和促生潛力。目前，生物防治大多使用單一菌劑，具有需菌量大、適應(yīng)性差等問(wèn)題。微生物菌劑的研究有向多菌復(fù)合發(fā)展的趨勢(shì)，利用不同功能菌株組合能提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，達(dá)到功能互補(bǔ)、更好地抑制病原菌的效果[35]。陳哲等[36]利用盆栽試驗(yàn)證實(shí)，復(fù)合菌芽胞桿菌對(duì)于草莓炭疽病的防治效果為 68.69%，比化學(xué)藥劑的防治效果提高了23.63%；同時(shí)，復(fù)合菌芽胞桿菌對(duì)草莓株高、葉片面積、根鮮重以及莖葉鮮重都有顯著促進(jìn)作用。葛紅蓮等[37]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌劑PB12能提高黃瓜幼苗的過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶活性，從而提高了植物防御病害的能力。另外，復(fù)合菌劑的施用使土壤蛋白酶、纖維素酶、脲酶和蔗糖酶活性升高，表明復(fù)合菌劑在一定程度上可改善土壤質(zhì)量，有助于土壤中的元素循環(huán)和生化反應(yīng)，有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)生產(chǎn)。