田菁種子內生菌的分離及其對萌發(fā)的影響

張凱曄, 劉曉琳, 董小燕,3, 劉潤進, 賀立恒, 解志紅,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 山西 太谷 030801；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003；3.中科院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071; 4.青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院, 山東 青島 266000)

內生菌是與植物共生的微生物，通常指的是至少某一個生活史階段與植物共生的微生物，內生菌主要包括真菌、細菌和放線菌[1]。內生菌在植物生長發(fā)育、抗逆境脅迫以及生態(tài)適應中具有重要的功能[2]。例如，用具有ACC酶活性的內生菌Pseudomonasmigulae8R6和PseudomonasfluorescensYsS6接種番茄種子，在正常及鹽脅迫下均可以促進番茄生長，提高生物量[3]。內生菌EnterobacterradicincitansDSM 16656具有固氮以及溶磷兩種促生特性，該內生菌不僅可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，而且該內生菌還可以通過刺激擬南芥水楊酸/乙烯信號途徑來提高植物抗病性[4]。由以上研究結果可見，內生菌是巨大的植物促生菌資源庫，分離培養(yǎng)內生菌可以應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，具有廣闊的前景。田菁(S.cannabina)為豆科田菁屬一年生草本植物，其鮮草養(yǎng)分十分豐富，作為改善土壤肥力的綠肥作物被廣泛種植。田菁根系發(fā)達，抗旱、抗病蟲害能力較強，且具有較強的耐鹽堿、耐洪澇能力[5]。田菁的根際微生物和內生菌對于其抗逆性具有重要作用。田菁根瘤菌主要分布于Ensifer、Neorhizobium和Rhizobium三個屬[6]。普通田菁大約苗齡10 d主根開始結瘤，在長達120 d固氮周期中[7]，其主根側根均有根瘤形成，所以其固氮能力較高，現(xiàn)已被廣泛應用到鹽堿地改良中。

種子表面與內部攜帶有豐富的微生物種群，可作為多種有益細菌和病原菌的載體，且內生菌的數(shù)量對種子的發(fā)育具有重要作用。馬同鎖等[8]研究發(fā)現(xiàn)，油菜種子內生菌數(shù)量與萌發(fā)率相關，內生菌數(shù)量下降萌發(fā)率降低。內生菌不僅可以影響種子的萌發(fā)，種子對內生菌的生長也具有調控作用，吳欣等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加種子提取物后內生菌的生長態(tài)勢，菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性也隨之提高。IAA能促進植物伸長，是常見的植物激素，同時也是植物生長發(fā)育調控的重要信號分子[10]；而溶磷菌則可以將土壤中植物難以吸收的不溶性磷元素轉化為可吸收型磷元素，促進植物生長[11]；鐵載體不僅可以幫助植物吸收土壤中鐵元素，而且可以通過與病原菌競爭鐵離子的吸收來達到拮抗作用[12]。外源接種具有促生特性的種子內生菌可以促進植物的生長，如Verma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，具有IAA產(chǎn)生能力、溶磷能力和拮抗病原菌Fusariumoxysporu的水稻種子內生菌可以促進根毛的發(fā)育和種子的生長以及活性氧的產(chǎn)生。在種子萌發(fā)過程中，內生菌移動至種子際開始定殖在種子表面和植物根部[14]。田菁所生存的鹽堿地土壤結構差，主要表現(xiàn)為土壤板結，且擁有特殊的微生物群落[15]。在田菁早期成長過程中伴隨著種子萌發(fā)，內生菌以及周圍環(huán)境中的微生物逐漸定殖到根部，形成根際微生物。種子內生菌作為在植物早期發(fā)育過程中的共生細菌，對于植物生長具有重要意義，然而田菁種子內生菌中是否有促生菌以及其促生機制還不清楚。因此，深入探究田菁種子內生菌的促生特性可以為田菁改良鹽堿地的田間應用提供理論依據(jù)。

本研究從普通田菁種子中分離篩選到了79株菌株，其中34株具有IAA分泌能力，對其中的6株進行16S rRNA基因序列分析，確認了它們的系統(tǒng)發(fā)育地位，并測定了溶磷能力和鐵載體合成能力，通過浸種發(fā)芽試驗進一步檢測內生菌的促生作用。本研究主要目的是探究普通田菁種子內生菌的種類及內生菌對種子發(fā)育所起的作用，同時挖掘促生菌用于生產(chǎn)實踐，旨在為微生物菌肥的研發(fā)與應用奠定試驗基礎。

1 材料和方法

1.1 田菁種子

普通田菁(S.cannabina)品種為魯菁一號，種子由山東省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.2 培養(yǎng)基

①LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、酵母膏5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂 10～20 g·L-1、pH 7.0～7.5。

②高氏一號培養(yǎng)基[16]：可溶性淀粉20 g·L-1、NaCl 0.5 g·L-1、KNO31 g·L-1、K2HPO4·3H2O 0.5 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1、瓊脂10～20 g·L-1、pH 7.2。

③Pikovskava無機解磷培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g·L-1、(NH4)2SO40.5 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1、FeSO4·7H2O 0.3 g·L-1、MnSO4·7H2O 0.03 g·L-1、Ca3(PO4)25 g·L-1、、pH 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基添加瓊脂15.0～18.0 g·L-1。

④CAS培養(yǎng)基[17]：鉻天青S 0.012 g、FeCl3溶液 10 mmol·L-1、HTDMA 0.015 g·L-1、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)6.04 g·L-1、瓊脂3.2 g·L-1、CaCl2溶液0.11 g·L-1、MgSO4·7H2O溶液0.25 g·L-1、20%葡萄糖、10%水解酪素、KH2PO415 g·L-1、NaCl 25 g·L-1、NH4Cl 50 g·L-1。

1.3 菌種分離

挑選田菁種子0.5 g，75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～5次，10%次氯酸鈉浸泡處理10 min，無菌水沖洗3～5次。由于田菁種子質地較堅硬，用磷酸緩沖液(NaCl 8 g·L-1、KCl 0.2 g·L-1、Na2HPO41.44 g·L-1、KH2PO40.24 g·L-1、pH 7.4)浸種48 h，然后進行研磨，取勻漿上清液1 mL稀釋為10-1～10-7，分別取100 μL涂布LB和高氏一號固體平板，每個稀釋梯度重復三次。將固體平板置于恒溫培養(yǎng)箱30℃暗培養(yǎng)。待菌株長成菌落后挑取不同菌落形態(tài)和大小的菌株利用平板劃線法純化，待所分離菌株菌落形態(tài)一致，以30%甘油保藏菌種。

1.4 16S rRNA擴增

采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG)和1492R(5’-GGTTACCTTGTT-ACGACTT)擴增16S rRNA序列，引物由睿博興科生物技術有限公司合成。PCR擴增體系：模版1 μL，引物各1 μL，2×EasyTaqPCRSuperMix 8 μL，加水補足20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保溫。獲得序列經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交睿博興科進行測序，獲得拼接序列后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，選取同源性較高模式菌株序列使用MEGA X 10.0.5進行序列比對構建進化樹。

1.5 內生菌株產(chǎn)IAA能力測定

將所分離的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h。隨后將菌液以1%接菌量轉接至含色氨酸(200 mg·L-1)LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h[18]。將菌株培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心1 min，取上清液與Salkowski比色液(0.5 mol·L-1FeCl3溶液10 mL，35% HClO4500 mL)等量混合，暗處放置30 min后觀察顯色情況，空白對照為未接菌的培養(yǎng)基與比色劑的混合液。與對照相比培養(yǎng)液變色的為陽性反應結果，即該菌株可分泌IAA。

配置100 mg·L-1IAA儲藏液，配置濃度為0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg·L-1的系列標準液。取各標準液2 mL，分別加入Salkowski試劑。置于恒溫培養(yǎng)箱40 ℃避光保溫30 min，酶標儀(TECAN Infinite, M200PRO)測量OD530(optical density, OD)，繪制標準曲線。

選取定性實驗呈陽性的菌株接種至含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)4 d。取菌液2 mL于離心管，10 000 r·min-1離心10 min，取100 μL上清液加入96孔板，加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30 min顯色，以酶標儀測定其OD530。利用標準曲線可得單位體積發(fā)酵液IAA的含量。

1.6 內生菌株解磷能力測定

將分離得到的內生菌接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，用打孔器在Pikovskava無機解磷固體培養(yǎng)基上打直徑約為0.5 cm的孔[19]，將菌液點入，30 ℃培養(yǎng)7 d，菌落周圍出現(xiàn)透明圈即為陽性。

采用鉬銻扛顯色法[20]定量測定溶解無機磷。①配置5 mg·L-1的磷標準溶液，比色管中加入1 mL鉬銻抗顯色劑，吸取不同量磷標準液于比色管中，加入1 mL鉬銻抗顯色劑，蒸餾水定容至10 mL。混勻靜置15～20 min，以酶標儀測量各反應液OD700。根據(jù)測量結果繪制磷標準曲線。②選取無機磷平板實驗的陽性菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)1 d。將菌液接種于無機磷培養(yǎng)基，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液8 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL加1 mL鉬銻抗顯色劑，超純水定容至10 mL，混勻靜置20 min，測量反應液OD700。用標準曲線可得發(fā)酵液的溶磷濃度。

1.7 內生菌產(chǎn)鐵載體的測定

將六株內生菌菌懸液點接至CAS培養(yǎng)基，每次5 μL，30 ℃培養(yǎng)48 h，設3個重復。觀察菌株生長，菌落周圍出現(xiàn)橙黃色暈圈即為可合成鐵載體。

1.8 內生菌促生效果檢測

將所選菌株接種于LB培養(yǎng)基30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，分別調節(jié)菌液OD600為0.25、0.50、1.00作為三種浸種液，以LB培養(yǎng)基(0)為對照。選擇飽滿形狀均一的魯菁一號田菁種子，表面消毒后，分別用不同菌株不同OD的菌懸液、LB液體培養(yǎng)基浸種1 h，每個處理處理約30粒種子，每個處理處理設置三個重復[21]。將種子放置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入10 mL滅菌水，置于恒溫培養(yǎng)箱30℃暗培養(yǎng)。觀察每日發(fā)芽情況。發(fā)芽數(shù)連續(xù)3 d不變之后停止統(tǒng)計。內生菌對種子萌發(fā)和幼苗的影響主要有以下指標需要測量[22]。

發(fā)芽勢(GE)=種子發(fā)芽達到最高峰的發(fā)芽粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

活力系數(shù)(VI)=幼苗生長勢(種苗全長)×發(fā)芽指數(shù)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

式中，Gt為第t天發(fā)芽數(shù)，Dt為相應發(fā)芽天數(shù)。

1.9 內生菌對種子胚根發(fā)育的影響

從每個處理組及對照組隨機選取10株測量其幼苗全長和胚根長度，計算胚根占全長的百分比，作為種子胚根的發(fā)育指標。

1.10 數(shù)據(jù)處理

所獲得的數(shù)據(jù)結果使用Excel 2017記錄及繪制圖表，并使用SPSS Statistic 20統(tǒng)計分析。采用ANOVA進行同一內生菌處理內顯著性分析，采用Duncan法兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離鑒定和實驗菌株的篩選

經(jīng)分離篩選，共得到79株內生菌。將內生菌的16S rRNA序列通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，分離獲得的內生菌主要屬于Bacillus、Azorhizobium、Cellulosimicrobium三個屬。其中Cellulosimicrobium2株、Bacillus38株、Azorhizobium39株。通過檢測發(fā)現(xiàn)共有34株具有產(chǎn)IAA活性，IAA產(chǎn)量范圍為(1.285±0.1911)～(25.47±1.873)mg·L-1。在具有IAA合成能力的內生菌中,Azorhizobium占比85.3%，Bacillus和Cellulosimicrobium分別占比11.7%、3%。IAA產(chǎn)量最高為菌株SC60，最低為菌株SC37。從這34株IAA合成菌株中選出SC5、SC17、SC24、SC45、SC59、SC60菌作為試驗對象。6株內生菌IAA產(chǎn)量如表1所示,產(chǎn)量在(8.922±0.096)～(25.47 0±1.873)mg·L-1內。

表1 內生菌的IAA產(chǎn)量

2.2 菌株16S rRNA分析

通過16S rRNA序列比對，獲取實驗菌株及與實驗菌株相似性高的代表菌株16S rRNA序列，構建發(fā)育系統(tǒng)樹,如圖1所示。從圖1可得知，SC5、SC17以及SC24與AzorhizobiumcaulinodansORS571的16S rRNA序列相似度最高，聚類于一支，序列相似性均高于99%。SC45、SC59、SC60與BacillusvelezensisCR-502聚類于一支，且三株菌與其序列相似性均高于99%。一般設定16S rRNA序列相似性超過97%的原核生物屬于一個種[23]。因此，SC5、SC17、SC24屬于Azorhizobiumcaulinodans，SC45、SC59、SC60屬于Bacillusvelezensis。

圖1 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 內生菌促生特性

定殖在根際的微生物通常會發(fā)揮其促進植物生長的特性，比如調節(jié)植物激素水平、溶磷、產(chǎn)氨氣以及產(chǎn)鐵載體等[24]。為了進一步探究所篩選的菌株的促生特性，本研究檢測了所選6株菌的溶磷能力和產(chǎn)鐵載體能力。

2.3.2內生菌鐵載體合成能力 鐵載體是微生物在限鐵條件下產(chǎn)生的小分子有機物，其結構復雜，可以特異性結合鐵離子。經(jīng)證明鐵載體可以增強細菌和植物對鐵離子的吸收。6株內生菌只有SC45可產(chǎn)鐵載體(表2)，SC45經(jīng)過CAS平板培養(yǎng)后產(chǎn)生了黃色暈圈，而不產(chǎn)鐵載體菌株點接后的陰性對照沒有變化(圖2)，由此證明SC45具有分泌鐵載體到環(huán)境中的能力。

圖2 CAS平板檢測產(chǎn)鐵載體

表2 內生菌的促生功能

2.4 內生菌對田菁種子的促生作用

種子萌發(fā)是植物生命周期的開始，種子萌發(fā)后環(huán)境微生物和內生菌定殖在植物，可用種子萌發(fā)試驗來判斷所接種的菌株是否具有促生效果。本研究主要檢測了種子萌發(fā)的發(fā)芽勢、種子活力系數(shù)和胚根占比。

2.4.1內生菌浸種對發(fā)芽勢的影響 發(fā)芽勢高代表種子萌發(fā)的較為快速且集中，有利于作物的生長，尤其在逆境脅迫下統(tǒng)一快速的出苗生長有利于植物適應外界環(huán)境，也有利于機械化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。經(jīng)過不同濃度菌液浸種處理，內生菌對種子發(fā)芽勢的影響如圖3所示，SC17浸種處理，在浸種菌液OD600為0.50和0.25時,田菁種子的發(fā)芽勢顯著提高，分別比OD600為0.00時提高了38.6%和36.3%(P<0.05)。由此可見，用SC17浸種會顯著促進種子萌發(fā)，其余菌株浸種對種子的發(fā)芽勢無顯著影響。

注：*代表與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4.2內生菌浸種對種子活力系數(shù)的影響 從圖4可得知，SC59和SC17浸種處理種子，種子活力在浸種菌液OD600為0.50，比CK(OD600=0.00)顯著提高了29.9%和26.7%；SC45和SC60在浸種菌液OD600為0.25時可顯著提高田菁種子的活力系數(shù)，分別可提高13.3%和14.1%；在較高濃度下，對種子活力系數(shù)影響不顯著。SC24和SC5浸種對種子活力系數(shù)影響不顯著。

注：*代表與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4.3內生菌浸種促進了胚根的發(fā)育 胚根的生長情況與植物的萌發(fā)和生長相關[25]，促進胚根的發(fā)育有利于促進植物的早期生長。內生菌浸種對幼苗胚根發(fā)育的影響如圖5所示。SC60在浸種菌液以OD600為0.50、0.25浸種后促進胚根的發(fā)育，胚根占幼苗全長的比例分別比CK(OD600=0.00)提高了29.5%、16.1%。以菌株SC17浸種菌液OD600為0.25浸種亦可促進胚根的發(fā)育，與對照相比，胚根占全長比例提高了13%。其余菌種浸種對胚根發(fā)育未見顯著性影響。

注：*代表與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

本研究分離到的菌株分布于三個屬：Bacillus、Azorhizobium、Cellulosimicrobium。分離到的菌株相較于根際微生物或者是其余組織的內生菌數(shù)量較少，這可能與田菁種子發(fā)育后期高滲透壓的環(huán)境[26]和分離過程中所選用的培養(yǎng)基種類較少相關。所分離到的菌株中Cellulosimicrobium屬于放線菌，在以往研究中該屬的菌株具有耐鹽堿及重金屬的特性，其與田菁耐鹽堿之間的相關性需要深入研究探索。

在種子萌發(fā)過程中，各種激素扮演著重要的作用。其中IAA與小分子物質KARs協(xié)同作用，調控著種子的萌發(fā)[27]，適量的外源IAA可以促進種子的萌發(fā)，IAA影響植物的側根發(fā)育、細胞分裂以及細胞延長[28]。分離自龍葵根際微生物的PGPB菌株Bacillussubtilis和Bacilluscereus均具有分泌IAA能力，可促進植物的生長[29]。因此，本文選取了6株可分泌IAA的菌株進行了研究，其中3株具有溶解無機磷能力，1株具有產(chǎn)鐵載體能力。植物在自然界中只可以利用礦質肥料中20%～30%的磷肥，這是由于礦物質磷肥在自然界中會和其他元素結合，例如鈣元素。使用具有溶磷能力的細菌可以使植物獲得更多的有效磷元素[30]。從香蕉根部分離的溶磷細菌溶解Ca3(PO4)2的能力在2～15.12 mg·L-1[31]，相較于本研究所選取的菌株溶磷能力較低。溶磷菌Bacillussp.具有產(chǎn)鐵載體能力(16.06 mg·L-1)和產(chǎn)IAA能力(30.58 mg·L-1)，接種薄荷后可以提高植物的鮮重和干重，提高出油率[32]。本研究所選取的菌株均可產(chǎn)IAA，部分內生菌具有溶磷和合成鐵載體特性。

通過種子發(fā)芽試驗發(fā)現(xiàn)，內生菌浸種可以提高種子萌發(fā)的發(fā)芽勢和種子活力系數(shù)，促進胚根的發(fā)育。該結果與核桃內生菌XHE8對紅莧菜種子萌發(fā)的影響結果[33]相似，內生菌雖然對種子萌發(fā)的影響不顯著，但促進了種子幼芽和根的發(fā)育。種子活力是一個重要的種子生理指標，對于快速統(tǒng)一的種子發(fā)育以及延長種子的儲存壽命有重要意義，最關鍵的是種子活力高可以幫助種子抵御萌發(fā)中的脅迫以及可以提高種子的耐儲存性[34]。本研究計算種子活力選用的是幼苗全長，種子活力高代表在一定時間內，幼苗生長受到了促進。干旱[35]、鹽、重金屬會抑制植物胚根的生長進而抑制植物生長，反之促進胚根發(fā)育可以促進植物的生長。

本研究分離的菌株中，SC60和SC17顯著促進了胚根發(fā)育和提高了種子活力，有利于種子統(tǒng)一快速出苗和幼苗的生長。SC60解磷能力較高，在后續(xù)植物的生長過程中有利于與植物吸收環(huán)境中的磷元素。因此，SC60可作為潛在的促生菌，用于提高種子活力促進幼苗發(fā)育和植物生長，具有一定的應用價值，可作為潛在綠色肥料。