美洲大蠊提取物YS-F對人非小細胞肺癌細胞A549增殖及凋亡的影響

倪連麗 閆爽 肖懷 巫秀美 何苗 李玥

摘 要 目的：探討美洲大蠊提取物對人非小細胞肺癌細胞A549增殖、凋亡的影響及其可能機制。方法：將美洲大蠊干燥蟲體以90%乙醇冷浸提取后，經(jīng)聚酰胺柱色譜以水-甲醇梯度洗脫，得20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇洗脫部位（YS-A～H）。采用MTT法篩選活性部位，并檢測不同劑量活性部位作用后的細胞增殖抑制率;采用流式細胞術(shù)檢測不同劑量活性部位作用后的細胞凋亡、細胞周期和線粒體膜電位變化情況。結(jié)果：YS-A～H的半數(shù)抑制濃度分別為（95.25±8.42）、（129.93±7.24）、（221.28±12.68）、（275.39±14.87）、（276.76±16.32）、（31.90±5.34）、（163.15±6.97）、（122.81±8.36）μg/mL，以YS-F的活性最強。經(jīng)YS-F 3、9、27、81 μg/mL作用24、48、72 h后，各時間點的細胞增殖抑制率均顯著升高，且藥物作用48、72 h時的細胞增殖抑制率顯著高于同組24 h，作用72 h時的細胞增殖抑制率均顯著高于同組48 h（P<0.01）。除YS-F 3 μg/mL作用24 h、YS-F 9 μg/mL作用72 h對壞死晚期細胞百分比，YS-F 3 μg/mL作用24 h對G2/M期細胞比例以及YS-F 3 μg/mL作用48 h對細胞線粒體膜電位降低率均無顯著影響（P>0.05）外，其余各劑量組各時間點凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比以及Sub-G0/G1期、S期細胞比例均顯著升高，G0/G1期、G2/M期細胞比例均顯著降低（P<0.01）;且藥物作用48、72 h時各劑量組凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比（除YS-F 9 μg/mL作用72 h時的壞死晚期細胞百分比外）以及Sub-G0/G1期、G2/M期（除48 h YS-F 3、9 μg/mL組外）細胞比例均顯著高于同組24 h，而G0/G1期、S期、G2/M期（除48 h YS-F 9 μg/mL組外）細胞比例均顯著低于同組24 h（P<0.01）;藥物作用72 h時各劑量組凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比（除YS-F 27 μg/mL作用72 h時的凋亡晚期和壞死早期細胞百分比以及YS-F 3、9 μg/mL作用72 h時的壞死晚期細胞百分比顯著降低外）以及S期（除72 h YS-F 3 μg/mL組外）、Sub-G0/G1期細胞比例均顯著高于同組48 h，而G0/G1期、G2/M期細胞比例均顯著低于同組48 h（P<0.01）。經(jīng)YS-F 9、27、81 μg/mL作用48 h后，細胞線粒體膜電位降低率均顯著升高，且YS-F 27、81 μg/mL組顯著高于YS-F 9 μg/mL組，YS-F 81 μg/mL組顯著高于YS-F 27 μg/mL組。結(jié)論：YS-F可通過阻滯細胞從S期向G2/M期轉(zhuǎn)化、降低線粒體膜電位等途徑來抑制A549細胞的增殖并促進其凋亡，且這種作用具有時間或劑量依賴性。

關(guān)鍵詞 美洲大蠊;非小細胞肺癌;A549細胞;增殖;凋亡;細胞周期;線粒體膜電位

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Periplaneta americana extract on the proliferation and apoptosis of human non-small cell lung cancer A549 cells as well as its possible mechanism. METHODS： The dry bodies of P. americana were soaked with 90% ethanol and eluted with gradient water-methanol by polyamide column chromatography. The 20%， 30%， 40%， 50%， 60%， 70%， 80%， 90% methanol elution sites （YS-A-H） were obtained. MTT method was used to screen the active site， and the inhibition rate of different doses of active site was detected. Flow cytometry was adopted to detect cell apoptosis， cell cycle and mitochondrial membrane potential of cells after treated with different doses of active site. RESULTS： Half inhibition concentrations of YS-A-H were （95.25±8.42）， （129.93±7.24）， （221.28±12.68）， （275.39±14.87）， （276.76±16.32）， （31.90±5.34）， （163.15±6.97）， （122.81±8.36） μg/mL， respectively. YS-F had the strongest activity. After treated with 3， 9， 27， 81 μg/mL YS-F for 24， 48， 72 h， cell proliferation inhibitory rate was increased significantly at different time points; after treated for 48， 72 h， that was significantly higher than same group after treated for 24 h; after 72 h treatment， that was significantly higher than same group after 48 h treatment （P<0.01）.? There was no significant effect of 24 h treatment of 3 μg/mL YS-F and 72 h treatment of 9 μg/mL YS-F on the percentage of cells in the late stage of necrosis， 24 h treatment of 3 μg/mL YS-F on the percentage of cells in G2/M phase and 48 h treatment of 3 μg/mL YS-F on the reduction rate of mitochondrial membrane potential （P>0.05）. The percentage of cells in the early stage of apoptosis， the late stage of apoptosis and the early stage of necrosis， the late stage of necrosis， as well as the percentage of cells in the Sub-G0/G1 and S phase at each time point were significantly increased in other different doses groups， while the percentage of cells in G0/G1 and G2/M phase was decreased significantly （P<0.01）. In each dose group， the percentage of cells in the early stage of apoptosis， the late stage of apoptosis and the early stage of necrosis， the late stage of necrosis （except for the percentage of cells in the late stage of necrosis treated with YS-F 9 μg/mL for 72 h） and the percentage of cells in Sub-G0/G1 phase， G2/M phase （except for YS-F 27， 81 μg/mL for 48 h） after treated for 48， 72 h were significantly higher than same group after 24 h of treatment; the percentage of cells in G0/G1 phase， S phase and G2/M phase （except for YS-F 9 μg/mL for 48 h） after treated for 48， 72 h were significantly lower than same group after 24 h of treatment （P<0.01）; the percentage of cells in the early stage of apoptosis， the late stage of apoptosis and the early stage of necrosis， the late stage of necrosis （except for the percentage of cells in the late stage of apoptosis and early stage of necrosis when treated with YS-F 27 μg/mL for 72 h， the percentage of cells in the late stage of necrosis when treated with YS-F 3，9 μg/mL for 72 h were decreased significantly） and the percentage of cells in S phase （except for YS-F 3 μg/mL for 72 h） and Sub-G0/G1 phase after treated for 72 h were significantly higher than same group after 48 h of treatment， while the percentage of cells in G0/G1 and G2/M phase were significantly lower than same group after 48 h of treatment （P<0.01）. After treated with YS-F 9， 27， 81 μg/mL for 48 h， the reduction rate of cell mitochondrial membrane potential was increased significantly; YS-F 27， 81 μg/mL groups were significantly higher than YS-F 9 μg/mL group， and YS-F 81 μg/mL group was significantly higher than YS-F 27 μg/mL group. CONCLUSIONS： YS-F can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of A549 cells by? preventing cell transformation from S phase to G2/M phase， and reducing mitochondrial membrane potential， in time-dependent or dose-dependent manner.

KEYWORDS? ?Periplaneta americana; Non-small cell lung cancer cell; A549 cells; Proliferation; Apoptosis; Cell cycle; Mitochondrial membrane potential

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）屬昆蟲綱蜚蠊科昆蟲[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“主血瘀癥堅，寒熱，破積聚，喉咽閉，內(nèi)寒無子”[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，美洲大蠊具有抗腫瘤、抑菌、修復(fù)受損組織等作用[3-5];其提取物對呼吸系統(tǒng)腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6]。張丹等[7]報道，美洲大蠊多肽提取物可通過上調(diào)人肝癌細胞SMMC-7721中促凋亡蛋白Bax的表達、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而發(fā)揮促進肝癌細胞凋亡的作用;CHEN PP等[8]研究發(fā)現(xiàn)，由美洲大蠊提取物制得的康復(fù)新液可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬來促進胃癌細胞的凋亡。本課題組參考上述文獻，以美洲大蠊干燥蟲體乙醇提取物為對象，經(jīng)不同體積分數(shù)的甲醇梯度洗脫、冷凍干燥后，制得各相應(yīng)洗脫部位（以下簡稱“YS”）;在篩選活性部位的基礎(chǔ)上，考察其對人非小細胞肺癌A549細胞增殖、細胞周期、線粒體凋亡等的影響，以期為美洲大蠊的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;SERIESⅡ型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;CKX41SF型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）;SN255939型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥材

美洲大蠊藥材購自大理市金貝小區(qū)中藥材市場（批號：150301），經(jīng)大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院楊自忠教授鑒定為美洲大蠊（P. americana L.）的干燥蟲體。

1.3 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（批號：1915379）、胎牛血清（FBS，批號：1828728）均購自美國Gibco公司;胰蛋白酶[密理博（中國）有限公司，批號：2046777];MTT試劑（批號：ST316）、二甲基亞砜（DMSO，細胞級，批號：RNBF1095）均購自美國Sigma公司;青-鏈霉素雙抗（美國Amersco公司，批號：20180330）;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）雙染色法細胞凋亡檢測試劑盒（批號：6033840）、PI染色法細胞周期檢測試劑盒（批號：6209516）、JC-1染色法細胞線粒體膜電位檢測試劑盒（批號：6113545）均購自美國BD公司;聚酰胺（30～60目，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，批號：20120316）;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.4 細胞

人非小細胞肺癌細胞A549（批號：KCB200434YJ）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫。

2 方法

2.1 YS的制備

美洲大蠊干燥蟲體經(jīng)粉碎后，用8倍量（g/mL）90%乙醇冷浸提取3次，每次7 d，合并提取液，濾過，濾液濃縮至流浸膏，以石油醚脫脂，得脫脂流浸膏。取上述脫脂流浸膏適量，經(jīng)聚酰胺柱色譜，依次以水和20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇洗脫，定量收集流分并合并同一體積分數(shù)的甲醇洗脫部位，經(jīng)濃縮后冷凍干燥，依次得YS-A～H等8個洗脫部位，得率分別為9.926 4%、0.125 0%、0.097 8%、0.118 0%、0.100 7%、0.234 2%、0.137 2%、0.043 7%。

2.2 細胞培養(yǎng)

A549細胞經(jīng)復(fù)蘇后，接種于含10%FBS、100 U/mL青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。

2.3 細胞增殖抑制率檢測及活性部位篩選

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期A549細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，以5 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為陰性對照組（有細胞組不含藥，下同）和美洲大蠊提取物YS-A～H不同劑量組（均為3、9、27、81 μg/mL，以各洗脫部位質(zhì)量計，劑量設(shè)置參考文獻[9]），并設(shè)置不含細胞或藥物的空白對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔?？瞻讓φ战M和陰性對照組均加入完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h;隨后加入DMSO 150 μL，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計算各部位的半數(shù)抑制濃度（IC50）。根據(jù)上述結(jié)果，選取抑制作用最強（即IC50值最?。┑南疵摬课粸榛钚圆课唬疾炱渥饔?4、48、72 h時的細胞抑制率。抑制率（%）=（陰性對照組平均OD值-試驗組平均OD值）/（陰性對照組平均OD值-空白對照組平均OD值）×100%。上述試驗重復(fù)3次（下同）。

2.4 細胞凋亡情況檢測

采用流式細胞術(shù)檢測。取經(jīng)胰蛋白酶消化的A549細胞，以1×106個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為陰性對照組和“2.3”項下篩選的美洲大蠊提取物活性部位不同劑量組（3、9、27、81 μg/mL，劑量設(shè)置參考“2.3”項），每組設(shè)3個復(fù)孔。陰性對照組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。分別于培養(yǎng)的24、48、72 h時，收集細胞，按Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，采用流式細胞儀檢測各組凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞占細胞總數(shù)的百分比（以下簡稱“細胞百分比”）。

2.5 細胞周期檢測

采用流式細胞術(shù)檢測。取經(jīng)胰蛋白酶消化的A549細胞，以1×106個/孔細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)的24、48、72 h時，收集細胞，按PI染色法細胞周期檢測試劑盒進行染色，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期，記錄各周期細胞比例。

2.6 細胞線粒體膜電位變化情況檢測

采用流式細胞術(shù)檢測。取經(jīng)胰蛋白酶消化的A549細胞，以1×106個/孔細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。于培養(yǎng)48 h（培養(yǎng)時間根據(jù)前期研究確定，此時細胞密度最佳且形態(tài)較為一致）時，收集細胞，按JC-1染色法細胞線粒體膜電位檢測試劑盒說明書進行操作，使用流式細胞儀檢測各組細胞線粒體膜電位的變化情況，并計算線粒體膜電位降低的細胞占細胞總數(shù)的百分比（即降低率）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。計量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 美洲大蠊提取物YS-A～H對A549細胞增殖的影響及活性部位的篩選結(jié)果

美洲大蠊提取物YS-A～H的IC50值分別為（95.25±8.42）、（129.93±7.24）、（221.28±12.68）、（275.39±14.87）、（276.76±16.32）、（31.90±5.34）、（163.15±6.97）、（122.81±8.36）μg/mL，詳見圖1。其中，YS-F的抑制作用最強，故以其作為活性部位進行后續(xù)試驗。

與陰性對照組比較，YS-F各劑量組細胞各時間點的抑制率均顯著升高，且藥物作用48、72 h時的抑制率顯著高于同組24 h，作用72 h時的抑制率均顯著高于同組48 h（P<0.01），詳見表1。

3.2 美洲大蠊提取物YS-F對A549細胞凋亡的影響

與陰性對照組比較，除YS-F 3 μg/mL作用24 h、YS-F 9 μg/mL作用72 h對壞死晚期細胞百分比無顯著影響（P>0.05）外，其余各劑量組各時間點凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比均顯著升高，且藥物作用48、72 h時的上述指標(biāo)（除YS-F 9 μg/mL作用72 h時的壞死晚期細胞百分比外）均顯著高于同組24 h，藥物作用72 h（除YS-F 9 μg/mL組凋亡晚期和壞死早期細胞百分比無顯著變化，YS-F 27 μg/mL組凋亡晚期和壞死早期細胞百分比以及YS-F 3、9 μg/mL組壞死晚期細胞百分比顯著降低外）均顯著高于同組48 h（P<0.01），詳見圖2、表2。

3.3 美洲大蠊提取物YS-F對A549細胞周期的影響

與陰性對照組比較，除YS-F 3 μg/mL作用24 h對G2/M期細胞比例無顯著影響（P>0.05）外，其余各劑量組各時間點G0/G1期、G2/M期細胞比例均顯著降低，Sub-G0/G1期、S期細胞比例均顯著升高;且藥物作用48、72 h時各劑量組G0/G1期、S期、G2/M期（除48 h YS-F 9 μg/mL組外）細胞比例均顯著低于同組24 h，各劑量組Sub-G0/G1期、G2/M期（除48 h YS-F 3、9 μg/mL組外）細胞比例均顯著高于同組24 h;藥物作用72 h時各劑量組G0/G1期、G2/M期細胞比例均顯著低于同組48 h，S期（除72 hYS-F 3 μg/mL組外）、Sub-G0/G1期細胞比例均顯著高于同組48 h（P<0.01），詳見表3、圖3。

3.4 美洲大蠊提取物YS-F對A549細胞線粒體膜電位的影響

與陰性對照組比較，YS-F 9、27、81 μg/mL組細胞線粒體膜電位降低率均顯著升高，且YS-F 27、81 μg/mL顯著高于YS-F 9 μg/mL組，YS-F 81 μg/mL組顯著高于YS-F 27 μg/mL組（P<0.01），詳見圖4、表4。

4 討論

根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[9]。肺癌的臨床治療以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)性高，患者遠期生存率偏低、療效欠佳[10]。因此，尋找毒副作用低且治療效果好的肺癌治療藥物極有必要。據(jù)相關(guān)學(xué)者報道，美洲大蠊提取物具有抑制人及小鼠肺癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡并阻滯其生長周期等作用[11-12]，故推測美洲大蠊提取物具有一定的促凋亡作用。為此，本課題組開展了相關(guān)研究。

細胞凋亡是抑制腫瘤生長的主要方式之一，其中線粒體是調(diào)控細胞凋亡的主要細胞器之一[13]。本研究首先采用MTT法對美洲大蠊醇提物的不同體積分數(shù)甲醇洗脫部位的增殖抑制活性進行了篩選。結(jié)果顯示，醇提物70%甲醇洗脫部位（YS-F）的IC50值最低，即增殖抑制活性最強，故以YS-F作為活性部位進行后續(xù)研究。結(jié)果顯示，以不同劑量YS-F作用于A549細胞后，各劑量組各時間點的細胞抑制率均較陰性對照組顯著升高，且48、72 h的抑制率顯著高于同組24 h，72 h時的抑制率顯著高于同組48 h，呈時間依賴性。

本研究進一步采用流式細胞術(shù)檢測了不同劑量YS-F對A549細胞凋亡、周期、線粒體膜電位變化的影響。結(jié)果顯示，YS-F 3 μg/mL作用24 h、YS-F 9 μg/mL作用72 h對壞死晚期細胞百分比，YS-F 3 μg/mL作用24 h對G2/M期細胞比例以及YS-F 3 μg/mL作用48 h對細胞線粒體膜電位降低率均無顯著影響;其余各劑量組各時間點凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比以及Sub-G0/G1期、S期細胞比例均較陰性對照組顯著升高，G0/G1期、G2/M期細胞比例均較陰性對照組顯著降低;且藥物作用48、72 h時各劑量組凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比（除YS-F 9 μg/mL作用72 h時的壞死晚期細胞百分比外）以及Sub-G0/G1期、G2/M期（除48 h YS-F 3、9 μg/mL組外）細胞比例均顯著高于同組24 h，而G0/G1期、S期、G2/M期（除48 h YS-F 9 μg/mL組外）細胞比例均顯著低于同組24 h;藥物作用72 h時各劑量組凋亡早期、凋亡晚期和壞死早期、壞死晚期細胞百分比（除YS-F 27 μg/mL作用72 h時的凋亡晚期和壞死早期細胞百分比以及YS-F 3、9 μg/mL作用72 h時的壞死晚期細胞百分比顯著降低外）以及S期（除YS-F 3 μg/mL組外）、Sub-G0/G1期細胞比例均顯著高于同組48 h，而G0/G1期、G2/M期細胞比例均顯著低于同組48 h。由此可見，隨著美洲大蠊提取物YS-F作用時間的延長，G0/G1、G2/M期細胞百分比均有所減少;而當(dāng)藥物作用72 h時，S期的細胞比例高于同組48 h，這可能與細胞自身凋亡增加有關(guān)。此外，在G0/G1期之前存在明顯的細胞凋亡期（Sub-G0/G1），這進一步提示了YS-F可誘導(dǎo)細胞凋亡，且具有一定的時間依賴性。此外，作用48 h后，YS-F 9、27、81 μg/mL組細胞線粒體膜電位降低率均顯著升高，且YS-F 27、81 μg/mL組顯著高于YS-F 9 μg/mL組，YS-F 81 μg/mL組顯著高于YS-F 27 μg/mL組。這提示YS-F可激活線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑，誘導(dǎo)A549細胞凋亡，并具有一定的劑量依賴性。筆者推測這種抗腫瘤作用可能與YS-F中含有肌苷、腺苷、次黃嘌呤等核苷類成分有關(guān)[14-15]，有待后續(xù)成分研究予以確認。

綜上所述，YS-F可通過阻滯細胞從S期向G2/M期轉(zhuǎn)化、降低線粒體膜電位等途徑來抑制人肺癌細胞A549的增殖并促進其凋亡，且這種作用具有時間或劑量依賴性。但本研究并未考察YS-F對人正常肺上皮細胞的影響，因此其對正常肺上皮細胞的殺傷作用尚需進一步驗證;同時，有關(guān)YS-F調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)凋亡的相關(guān)信號通路和分子靶點仍有待后續(xù)研究進一步完善。

（致謝：本研究在大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室完成，感謝實驗室的老師和同學(xué)對本文的指導(dǎo)和幫助）

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（收稿日期：2019-06-21 修回日期：2019-12-05）

（編輯：張元媛）