超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)桃中吡唑醚菌酯和啶酰菌胺殘留和消解

劉倩宇 ，劉穎超 ，董豐收 ，徐軍 ，吳小虎 ，劉新剛 ，鄭永權(quán)

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

桃（Prunus persicaL.）肉質(zhì)鮮美，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和果酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用[1]。褐腐病是一種危害桃樹的世界性病害，其傳播快、分布廣，成熟期發(fā)病最多，嚴(yán)重影響桃果產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺對(duì)桃褐腐病具有良好的防效[3-4]。實(shí)際生產(chǎn)中，該藥劑在桃樹坐果期大量應(yīng)用。因此，開展關(guān)于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃果中殘留行為的研究具有重要意義。

吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）是一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過阻止細(xì)胞色素b和C1間的電子傳遞，抑制線粒體呼吸作用，從而破壞病原菌能量循環(huán)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。啶酰菌胺（boscalid）是一種煙酰胺類廣譜殺菌劑，通過抑制病原菌有氧呼吸三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶活性，干擾細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，從而起到殺菌作用[6]。關(guān)于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[8]、高效液相色譜法（HPLC）[9]和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[10]等。前處理方法有固相萃取[11]、液液萃取[12]、分散固相萃取[8]和QuECh-ERS[10]法。其中QuEChERS前處理方法結(jié)合LC-MS，靈敏度高，重復(fù)性好。關(guān)于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在草莓[10]、葡萄[11]和黃瓜[13]中的殘留行為已有報(bào)道，但有關(guān)吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的檢測(cè)方法及殘留研究未見報(bào)道。

目前，我國(guó)規(guī)定吡唑醚菌酯在桃上的最大殘留限量（MRL）為1 mg/kg，未規(guī)定啶酰菌胺在桃上的MRL[14]，歐盟規(guī)定啶酰菌胺在桃上的MRL為5 mg/kg[15]。為評(píng)價(jià)吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃果上的殘留及消解水平，本研究建立UPLC-MS/MS快速檢測(cè)吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的殘留分析方法，并開展吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上的消解動(dòng)態(tài)研究，為其安全使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLC-TQD超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、ACQUITYUPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Waters公司；CK-2000高通量組織研磨儀，托摩根生物科技有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；Mili-Q超純水儀，美國(guó)Milipore公司。

吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.6%），啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.6%），北京勤誠(chéng)亦信科技開發(fā)有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）（40 μm）、Filter Unit濾膜（0.22 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司；乙腈、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；38%唑醚·啶酰菌水分散粒劑，巴斯夫（中國(guó)）有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照NY/T788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[16]，于2018年4—8月分別在北京市大興區(qū)、山西省晉中榆次區(qū)、河南省濟(jì)源市以及湖南省長(zhǎng)沙市的桃園中進(jìn)行38%唑醚·啶酰菌水分散粒劑在桃樹上的殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。設(shè)置空白對(duì)照區(qū)和消解動(dòng)態(tài)區(qū)，每個(gè)小區(qū)有桃樹4株，每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)排列，處理間設(shè)保護(hù)帶。在桃褐腐病發(fā)病初期，按推薦最高劑量有效成分用量253.3 mg/kg，制劑用量1 500倍液兌水莖葉噴霧1次。分別于施藥后7、14、21、28、35 d采集桃樣品，隨機(jī)取樣2 kg，縮分留樣200 g，勻漿后-20℃低溫冷凍保存待測(cè)。

1.3 分析方法

1.3.1 檢測(cè)條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液、乙腈，流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI＋）。毛細(xì)管電壓3.5 kV，離子源溫度150℃，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣（N2）流量650 L/h，錐孔反吹氣（N2）流量50 L/h。采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），具體參數(shù)見表1。

表2 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 樣品前處理

稱取10.0g（精確到0.01 g）均質(zhì)桃樣品于含50 mL聚四氟乙烯的離心管中，加入5 mL超純水，渦旋3 min后加入10 mL乙腈，2 000次/min振蕩提取10 min，然后加1 g NaCl和4 g無(wú)水硫酸鎂，2 000次/min迅速振蕩5 min，再以4 000 r/min離心5 min后，移取1.5 mL上清液（乙腈層）至裝有50 mg PSA和150 mg無(wú)水硫酸鎂的2 mL離心管中，2 000 r/min渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min后，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，于-20℃貯存待測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用電子天平分別稱取0.010 14 g吡唑醚菌酯（98.6%）和啶酰菌胺（98.6%）標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈作溶劑配制100 mg/L儲(chǔ)備液100 mL，于4℃避光保存。

用色譜純乙腈梯度稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液；用空白桃樣品提取液稀釋，配制上述質(zhì)量濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 添加回收試驗(yàn)

分別添加3個(gè)水平的吡唑醚菌酯和啶酰菌胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白桃均質(zhì)樣品中，其添加水平分別為0.01、1.00、2.00 mg/kg。按1.3.1條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的殘留量隨時(shí)間變化，可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程表示。

式中：Ct為時(shí)間t時(shí)的農(nóng)藥殘留量，mg/kg；C0為施藥后的原始沉積量，mg/kg；k為消解系數(shù)，d-1；t為施藥后時(shí)間，d。

通過式（1）得到的消解系數(shù)k，通過式（2）即可計(jì)算消解半衰期T1/2。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件優(yōu)化

為使吡唑醚菌酯、啶酰菌胺的測(cè)定達(dá)到最佳靈敏度和最佳分離效果，將0.1 mg/L吡唑醚菌酯和啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在掃描范圍100～500m/z直接進(jìn)樣，選擇合適的離子源。在電噴霧離子源、正離子模式下，吡唑醚菌酯和啶酰菌胺均具有較好的電離效果，并獲得特征離子峰［M＋H］。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化監(jiān)測(cè)離子、錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，最終優(yōu)化條件如1.3.1所述。進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，在流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時(shí)，得到較好的靈敏度、重現(xiàn)性及峰形（圖1）。

2.2 方法的線性范圍、靈敏度

基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量分析，結(jié)果表明吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在0.01～2 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。其回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別是：y=2 798.5x＋156 696，R2=0.990 9（吡唑醚菌酯）；y=434.84x＋6 166.7，R2=0.999 2（啶酰菌胺）。在0.01、1.00、2.00 mg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯在桃中的平均回收率為89.8～96.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～5.4%；啶酰菌胺在桃中的平均回收率為81.1%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～8.9%（表3）。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的定量限均為0.01 mg/kg。

圖1 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（0.01 mg/L）

表3 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.3 吡唑醚菌酯、啶酰菌胺在桃中的消解動(dòng)態(tài)

吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的消解動(dòng)態(tài)均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程回歸曲線Ct=C0e-kt，吡唑醚菌酯在北京、山西、河南、湖南等4個(gè)地區(qū)桃中的半衰期分別為15.8、7.8、13.1、7.2 d；啶酰菌胺在北京、山西、河南、湖南等4個(gè)地區(qū)桃中的半衰期分別為11.0、7.1、11.8、7.0 d，結(jié)果見表4。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同地區(qū)的消解動(dòng)態(tài)曲線見圖2，兩者均在山西和湖南消解較快，在北京和河南消解較慢。

表4 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中消解動(dòng)態(tài)

圖2 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同地區(qū)的消解動(dòng)態(tài)

3 結(jié)論與討論

本研究在QuEChERS方法基礎(chǔ)上，建立了UPLCMS/MS測(cè)定桃中吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的殘留分析方法。在0.01～2.00 mg/L范圍內(nèi)，吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的濃度與色譜峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；在添加水平為0.01～2.00 mg/kg時(shí)，吡唑醚菌酯在桃中的平均回收率為89.8%～96.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～5.4%；啶酰菌胺在桃中的平均回收率為81.1%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～12.1%。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的定量限均為0.01 mg/kg。與楊霄鴻等[10]建立的HPLC-MS/MS測(cè)定吡唑醚菌酯和啶酰菌胺殘留方法相比，本方法的定量限更低，靈敏度更高，且操作快速、簡(jiǎn)便。

據(jù)報(bào)道，吡唑醚菌酯在草莓上的消解半衰期為4.8～6.0 d[10]，在辣椒上為5.1～7.0 d[17]，在花生上為10.3～11.2 d[18]；啶酰菌胺在草莓上的消解半衰期為5.1～11.0 d[10]，在黃瓜上為2.67～9.90 d[14]，在番茄上為7.6～11.7 d[19]。本研究結(jié)果表明，吡唑醚菌酯在桃上的消解半衰期為7.2～15.8 d；啶酰菌胺在桃上的消解半衰期為7.0～11.8 d。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同作物的消解半衰期差異不大，均屬于易降解農(nóng)藥。本研究提供了吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上殘留分析方法及消解動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，為吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上的安全使用提供參考。