Tgfβ信號通路介導(dǎo)孕酮注射導(dǎo)致的初生仔鼠子宮腺體缺失

王科智,許祺欣,蘇仁偉 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州510000)

子宮腺體是雌性哺乳動物子宮的重要組成部分,腺體以及其分泌物對妊娠的建立和維持是十分重要的[1]。包括畜牧動物豬、牛、羊和人以及嚙齒類在內(nèi)的多種哺乳動物中,子宮腺體都被證明可以合成并分泌多種酶類、生長因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、激素、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及其他一些物質(zhì),這些物質(zhì)為著床前胚胎、胎兒以及胎盤提供營養(yǎng)物質(zhì)以支持其著床,妊娠識別以及生長發(fā)育[2]。在妊娠期間,受來自卵巢和胎盤的激素的時(shí)空性調(diào)控,腺體會發(fā)生增生和肥大[3-4],分泌量增加,并為整個(gè)妊娠期間胎兒的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。人懷孕的前3個(gè)月,由于胎盤發(fā)育不完全,胎兒的營養(yǎng)供給主要以這種組織營養(yǎng)為主,在后期胎盤發(fā)育完全以后才轉(zhuǎn)為以血液營養(yǎng)為主。而在其他畜牧動物特別是豬、馬等胚胎著床方式為表面著床的動物中,由子宮腺體帶來的組織性營養(yǎng)貫穿其整個(gè)妊娠過程,為胎兒的發(fā)育提供營養(yǎng)支持[5]。研究表明,在多種哺乳動物中,因各種因素導(dǎo)致子宮腺體缺失的雌性個(gè)體都是不孕的[6-8]。

大部分雌性哺乳動物在剛出生的時(shí)候子宮是處于未發(fā)育完全的狀態(tài),僅由數(shù)層間充質(zhì)細(xì)胞和單層腔上皮細(xì)胞組成,此時(shí)的子宮內(nèi)不含有任何的腺體。根據(jù)物種的不同,子宮內(nèi)的腺體發(fā)育一般持續(xù)一到兩周的時(shí)間,在此期間部分子宮腔上皮增殖分化,向基質(zhì)遷移,最終形成腺體,該過程稱之為子宮腺體的發(fā)生。以小鼠為例：在出生后第5天(postnatal day 5,PND5)左右,子宮內(nèi)膜腔上皮在部分位點(diǎn)開始內(nèi)陷到子宮間充質(zhì)中,直到PND7,才能在組織學(xué)上分辨出子宮腺芽的存在,腺體從PND10左右開始向子宮內(nèi)膜基質(zhì)中擴(kuò)展,直到PND15基本發(fā)育完成[8]。在山羊和小鼠等多種哺乳動物,給新生雌性幼崽連續(xù)皮下注射一定劑量的孕酮(P4),可導(dǎo)致其子宮內(nèi)腺體發(fā)生障礙從而造成成年動物子宮腺體的缺失,進(jìn)而導(dǎo)致雌性動物不孕[8]。然而,P4導(dǎo)致小鼠子宮腺體缺失的機(jī)制仍不是很清楚,目前已經(jīng)證明與該過程有關(guān)的只有Wnt信號通路[9]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β,Tgfβ)超家族成員在卵泡發(fā)育、排卵、卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞交流、子宮蛻膜化以及胚胎發(fā)育和機(jī)體成熟過程中參與了很多細(xì)胞分化過程并起到了決定性的作用[10-12]。該超家族的配體包括Tgfβs、activins和骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,Bmps),這些配體與它們的膜結(jié)合Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合,形成一個(gè)復(fù)雜的結(jié)合物進(jìn)而發(fā)揮作用[13]。其中Tgfβ信號通路包括配體Tgfβs、受體Tgfβrs、轉(zhuǎn)錄因子Smads以及下游靶基因[12]。在小鼠中,能夠與Tgfβ結(jié)合的受體有3種：Tgfβr1、Tgfβr2和Tgfβr3,分別由Tgfbr1-3基因編碼。Tgfβr2可以直接與配體結(jié)合,Tgfβr1 只 能 與 結(jié) 合 在Tgfβr2 上 的 配 體 結(jié) 合,Tgfβr3則是Tgfβ的共同受體,能夠作為Tgfβ儲存庫幫助Tgfβs與Tgfβr1和Tgfβr2結(jié)合。有研究表明,在新生小鼠子宮特異性過激活Tgfβr1能夠抑制子宮腺體的發(fā)育并影響Wnt信號通路的表達(dá)[14-15]。因此,我們假設(shè)Tgfβ信號通路可能參與了P4注射導(dǎo)致小鼠子宮腺體缺失的過程。為了驗(yàn)證這一假設(shè),收集經(jīng)P4處理過的新生仔鼠子宮上皮細(xì)胞,檢測Tgfb信號通路受體基因Tgfbr1、Tgfbr2、Tgfbr3以及下游靶基因的m RNA 表達(dá)水平,并使用Tgfβ信號通路抑制劑LY364947部分挽救了P4處理組小鼠子宮腺體的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物所使用到的孕鼠為C57BL/6J品系,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,室內(nèi)溫度22～24℃,相對濕度60%～70%,光照和黑暗時(shí)間各12 h。孕鼠分娩出仔鼠當(dāng)天記為出生后第1天(PND1)。

P4注射：試驗(yàn)分對照組和試驗(yàn)組,每組各3只,試驗(yàn)組在PND2～PND6和PND2～PND10每天皮下注射P4(Sigma,按體質(zhì)量50 ng/g),對照組皮下注射等體積的芝麻油。于PND7和PND15取材仔鼠子宮,取材時(shí)將仔鼠斷頭處死,取出子宮后剔除系膜以備后續(xù)試驗(yàn)檢測。

P4、Tgfβ受體抑制劑注射：試驗(yàn)分為對照組和試驗(yàn)組,對照組4只小鼠,試驗(yàn)組5只小鼠。對照組在PND2～PND10每天頸部皮下注射P4(按體質(zhì)量50 ng/g)和腹部皮下注射5%DMSO(生理鹽水配制),試驗(yàn)組在PND2～PND10每天皮下注射P4(按體質(zhì)量50 ng/g)和腹部皮下注射能夠抑制Ⅰ型和Ⅱ型Tgfβ受體的抑制劑(Selleck,LY364947,按體質(zhì)量1μg/g),于PND15取材并包埋切片。

1.2 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)的消化和分離消化體系配制如表1,將清洗干凈的子宮加入消化體系內(nèi),4℃消化1.5～2.0 h,每隔0.5 h將離心管上下顛倒5～10次。消化完成后,將子宮轉(zhuǎn)移至10% FBS中終止消化,然后用1×PBS清洗3次。

表1 消化體系配方

在解剖鏡下,用鑷子輕輕固定住子宮一端,在毛細(xì)管中吸入一定體積的液體；將毛細(xì)管尖端緩慢插入鑷子固定好的子宮一端內(nèi)大概3 mm,將子宮內(nèi)膜腔上皮較為完整的沖出來；在1×PBS中洗干凈后,于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 免疫熒光觀察將分離出來的子宮上皮細(xì)胞在培養(yǎng)液中輕輕吹散,接種于放置了蓋玻片的24孔板內(nèi),放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待形成貼壁的單層細(xì)胞后,去除培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛室溫固定20 min；用1×PBS 洗3 遍,每遍5 min；用0.1% Tween-20室溫處理20 min；1×PBS洗3遍,每遍5 min；用5%驢血清37℃封閉1 h；孵育一抗,4℃過夜(Vimentin,1∶100；Cytokeratin18,1∶100)；去除一抗,1×PBS洗3遍,每遍5 min；二抗37℃孵育30 min；1×PBS洗3遍,用含有DAPI的封片劑封片,使用激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS SP8)觀察并拍照。

1.4 HE 染色與免疫組織化學(xué)檢測于PND15取材小鼠子宮,用4%多聚甲醛固定過夜,包埋后進(jìn)行石蠟切片(5μm),脫蠟后進(jìn)行HE 染色。10%馬血清封閉后與Foxa2 抗體(Abcam,1∶100)孵育過夜,然后進(jìn)行酶標(biāo)二抗孵育和DAB 染色,拍照并統(tǒng)計(jì)每個(gè)切片上的Foxa2陽性表達(dá)的腺體數(shù)量,每只小鼠子宮統(tǒng)計(jì)10～20片切片。

1.5 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR將分離的上皮轉(zhuǎn)移入無RNA 酶離心管中,使用TRIzol法提取總RNA,用NanoDrop(NanoDrop 2000c)測量RNA 濃度。使用PrimeScriot RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：50℃15 min,85℃5 s,得到cDNA。

使用Ta KaRa SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒,采用BIORAD-CFX96TMReal-time System 進(jìn)行。PCR 反應(yīng)條件：95℃10 s；95℃5 s,60℃34 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。使用Rpl19作為內(nèi)參,檢測目的基因m RNA 水平的表達(dá)。所有引物由上海生工生物科技有限公司合成,引物如表2所示。

表2 Real-time PCR 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析根據(jù)Real-time PCR 系統(tǒng)軟件導(dǎo)出的相應(yīng)基因的Ct值,按照ΔΔCt法計(jì)算：ΔΔCt＝(試驗(yàn)組目的基因Ct值－試驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值)/(對照組目的基因Ct值－對照組內(nèi)參基因Ct值),試驗(yàn)處理組與對照組中靶基因相對表達(dá)的差異倍數(shù)計(jì)算公式：N(處理組/對照組)＝2－ΔΔCt。

根據(jù)Foxa2染色結(jié)果,統(tǒng)計(jì)每張切片上的腺體數(shù)量,計(jì)算每只小鼠每片組織切片上的平均腺體數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)果使用GraphPad Prism6 軟件進(jìn)行ttest統(tǒng)計(jì)分析,取P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 子宮上皮分離及純度檢測試驗(yàn)首先分離PND10子宮腔上皮,結(jié)果得到一條結(jié)構(gòu)基本完整的子宮上皮。其中對照組的子宮上皮存在很多小的突起,為子宮腺芽(圖1a),而P4處理組的小鼠子宮腔上皮表面很光滑,沒有腺芽的存在(圖1b),說明P4處理確實(shí)可以導(dǎo)致子宮腺體發(fā)生障礙。

為了證明分離出來的子宮上皮細(xì)胞不含有間充質(zhì)細(xì)胞,利用免疫熒光法檢測對照組上皮中相關(guān)特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)。如圖1c所示,在分離的上皮細(xì)胞中沒有檢測到間充質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的Vimentin,而幾乎所有的細(xì)胞都表達(dá)上皮特異性表達(dá)的標(biāo)志分子Cytokeratin18(圖1d)。以上結(jié)果表明,本研究中分離出的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度極高,沒有間充質(zhì)細(xì)胞的污染。

圖1 子宮內(nèi)膜上皮純度檢測 a.注油組子宮腔上皮(×5)；b.注P4組子宮腔上皮(×5)；c.Vimentin染色；d.Cytokeratin18染色(Bar＝100μm)

2.2 P4處理上調(diào)子宮上皮中Tgfbrs及靶基因mRNA的表達(dá)PND7是小鼠子宮腺體發(fā)育出芽的關(guān)鍵時(shí)期,因此檢測這一時(shí)期子宮上皮中Tgfβ的3種受體基因Tgfbr1、Tgfbr2和Tgfbr3的表達(dá)是否受到P4的調(diào)節(jié)。如圖2所示,與注油的對照相比,注射P4的子宮上皮細(xì)胞中Tgfbr1 m RNA 表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,而Tgfbr2和Tgfbr3 m RNA 表達(dá)水平在P4的作用下有所上調(diào)。

為了檢測上調(diào)的Tgfβ 受體表達(dá)是否導(dǎo)致了Tgfβ信號通路的激活,還檢測了Tgfβ信號通路的下游靶基因Serpine1、Ctgf和Mmp9的表達(dá)。結(jié)果顯示,P4處理后3個(gè)靶基因的表達(dá)都有上調(diào),其中Ctgf和Mmp9的上調(diào)表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2。這些結(jié)果表明,在P4導(dǎo)致的新生小鼠子宮腺體缺失過程中,Tgfβ信號通路被激活,可能在這一過程中介導(dǎo)了P4的作用。

圖2 PND7子宮上皮細(xì)胞中Tgfbrs以及下游靶基因mRNA 表達(dá)水平 ?表示P＜0.05

2.3 抑制Tgfβ受體能夠挽救P4處理導(dǎo)致的腺體缺失為了進(jìn)一步確定Tgfβrs在P4處理導(dǎo)致子宮腺體缺失的過程中所發(fā)揮的作用,使用小分子抑制劑LY364947對Tgfβ進(jìn)行抑制。Y364947 可以同時(shí)對Tgfβr1 和Tgfβr2 的功能進(jìn)行抑制。利用P4和LY364947同時(shí)處理仔鼠,并在PND15 檢測抑制Tgfβ信號通路是否能夠挽救P4處理導(dǎo)致的子宮腺體缺失。結(jié)果如圖3所示：在PND15,注油組子宮中有數(shù)量較多的腺體(圖3a),而注P4組子宮中沒有發(fā)現(xiàn)腺體的存在(圖3b)；注射P4和DMSO 組仔鼠子宮中基本沒有腺體的存在(圖3c),而注射P4和Tgfβ受體抑制劑組仔鼠子宮中出現(xiàn)了部分腺體(圖3d)。

為了進(jìn)一步精確計(jì)數(shù)子宮腺體的數(shù)量,利用免疫組化技術(shù)檢測腺體的標(biāo)志性分子Foxa2的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示：在注射P4和DMSO 的對照組中只有25%小鼠的子宮中出現(xiàn)Foxa2陽性染色,而注射P4和抑制劑組的試驗(yàn)組中有80%小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)了腺體的存在(圖4a～c)。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組每張切片上的腺體數(shù)量明顯高于對照組每張切片上的腺體數(shù)量(圖4d)。這些結(jié)果表明通過抑制Tgfβ信號通路能夠在一定程度上挽救P4介導(dǎo)的子宮腺體缺失。

圖3 子宮上皮HE染色 a.注油組小鼠PND15子宮；b.注P4組小鼠PND15子宮；c.注P4和DMSO 組PND15子宮；d.注P4和抑制劑組PND15子宮。Bar＝100μm

圖4 Foxa2免疫組化以及腺體數(shù)量統(tǒng)計(jì) a.注P4和DMSO 組PND15子宮；b.注P4和抑制劑組PND15子宮；c.試驗(yàn)組和對照組各自含有腺體的小鼠數(shù)量所占小鼠總數(shù)的百分比；d.試驗(yàn)組和對照組每張切片上的腺體數(shù)量比較(Bar＝100μm；?表示P＜0.05)

3 討論

雌性哺乳動物的子宮腺體及其分泌物對妊娠的建立和維持十分重要[1],子宮腺體及其功能的異?？捎绊懼睬芭咛グl(fā)育、胚胎著床以及胎兒和胎盤生長發(fā)育并最終影響妊娠結(jié)局[2]。在靈長動物特別是人類女性中,每次月經(jīng)過后子宮內(nèi)膜都會經(jīng)歷一次修復(fù)和重建的過程,該過程需要重建全部的腔上皮和部分的腺上皮,如果重建出現(xiàn)問題可能會影響子宮的接受性,甚至導(dǎo)致不孕[16]。在畜牧生產(chǎn)中,特別是豬等著床方式為表明著床的動物中,胚胎在著床以前在子宮中長時(shí)間漂浮而不會與母體子宮建立直接聯(lián)系；而且由于其胎盤類型的限制,即便著床后的胚胎對組織性營養(yǎng)的需求也高于嚙齒類和靈長類,因此深度了解子宮腺的發(fā)育可以提高畜牧生產(chǎn)效率[17]。本研究結(jié)果證明Tgfβ信號通路在注射P4的初生小鼠子宮上皮中被激活,并且部分介導(dǎo)了P4注射導(dǎo)致的子宮腺體缺失,為子宮腺體發(fā)育的分子機(jī)制提供了新的證據(jù)。

研究結(jié)果顯示,在PND7這一腺體發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,P4可以調(diào)節(jié)子宮上皮中TgfβⅡ型受體Tgfbr2和Ⅲ型受體Tgfbr3 而不是Ⅰ型受體Tgfbr1 的表達(dá),提示可能是Ⅱ型和Ⅲ型Tgfβ受體而不是Ⅰ型受體介導(dǎo)了新生仔鼠P4注射導(dǎo)致的腺體缺失。其中,Tgfβr3是一種輔助型受體,它的存在可以有效促進(jìn)Tgfβs與Tgfβr1 以 及Tgfβr2 的 結(jié) 合,因 此 推 測Tgfβr2可能在P4介導(dǎo)的子宮腺體缺失中發(fā)揮主要作用。但Tgfbr3 m RNA 表達(dá)的顯著上調(diào)也說明Tgfβr3在P4誘導(dǎo)的Tgfβ信號通路的激活中起到重要作用。目前,僅有持續(xù)激活Ⅰ型受體Tgfbβ1導(dǎo)致子宮腺體發(fā)生障礙的報(bào)道[14],而尚未見持續(xù)激活Ⅱ型受體Tgfβr2和Ⅲ型受體Tgfβr3的研究報(bào)道。這與我們的研究結(jié)果看似是矛盾的,但是,Tgfβr1 的持續(xù)激活只是一種人為的干預(yù),只有Tgfβr1的表達(dá)不受P4的調(diào)節(jié)并不能否定P4通過調(diào)節(jié)Tgfβ信號通路來抑制子宮腺體發(fā)生的可能。并且,據(jù)報(bào)道,Tgfβr1只能與結(jié)合在Tgfβr2上的配體結(jié)合[18],上調(diào)的Tgfβr2也可通過輔助Tgfβr1來激活下游信號通路,這與直接過激活Tgfβr1 的結(jié)果可能是一致的。

無論是Ⅰ型還是Ⅱ型Tgfβ受體的激活均能通過磷酸化下游的Smad2/3 激活下游基因的表達(dá)[14-15]。在本研究中,受P4的影響,Tgfβ下游靶基因Ctgf和Mmp9也受到了明顯的上調(diào),說明P4誘導(dǎo)的Tgfβ受體表達(dá)上調(diào)可以引起該信號通路的激活。小分子抑制劑LY364947可以同時(shí)抑制Ⅰ型和Ⅱ型Tgfβ受體的活性,在本研究中發(fā)現(xiàn)該抑制劑可以部分挽救由P4導(dǎo)致的PND15 小鼠子宮腺體缺失,進(jìn)一步證明Tgfβ信號通路介導(dǎo)P4注射引起的小鼠子宮腺體缺失的可能性。但是,這種挽救的能力是極其有限的,P4和LY364947處理組的小鼠子宮腺體數(shù)量雖然顯著高于P4＋DMSO 組小鼠,但仍遠(yuǎn)低于未受P4影響的正常PND15仔鼠子宮中腺體數(shù)量,表明Tgfβ信號通路僅能部分介導(dǎo)P4在子宮腺體缺失過程中的作用,其他信號通路也可能參與了這個(gè)復(fù)雜的過程。Wnt信號通路是最早被證明在P4處理的新生小鼠子宮中受到調(diào)節(jié)的信號通路[9],但Wnt信號通路是否直接介導(dǎo)了P4的作用還缺乏直接的證據(jù)。在子宮特異性過激活Tgfβr1的新生小鼠子宮中,Wnt信號通路的表達(dá)也受到了影響[14-15]。結(jié)合本研究的結(jié)果,P4、Tgfβ和Wnt信號通路的相互作用可能在這一過程中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述,本研究初步證明了Tgfβ信號通路能夠介導(dǎo)P4導(dǎo)致的子宮腺體缺失,但只是部分介導(dǎo)了P4的作用,這一過程是否有其他信號通路的參與還需要進(jìn)一步的研究。此外,P4調(diào)節(jié)Tgfbrs表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制也需要進(jìn)一步的研究和探索。