影響H1N1亞型豬流感病毒致病性與傳播性的分子機制研究進展

施麗薇,顧 敏,2,3,劉秀梵,2,3? (.揚州大學(xué) 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點開放實驗室,江蘇 揚州225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,江蘇揚州225009)

1 豬流感概述

豬流感(swine influenza,SI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒(swine influenza virus,SIVs)引起的豬急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。A 型流感病毒是有囊膜、分節(jié)段的負股RNA病毒,有8個基因片段,根據(jù)長度依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS,至少編碼10個蛋白。病毒囊膜表面存在HA 和NA 兩種蛋白,根據(jù)抗原性將HA 分為H1-H18 共18 個亞型,NA 分為N1-N11共11 個 亞 型[1-2],PB2、PB1、PA 組 成 病 毒 的RNA 聚合酶,行使病毒RNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制功能；NP 蛋白為核蛋白；M 基因編碼基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2；NS蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白,包括NS1和NS2。目前全球流行的SIVs有H1N1、H1N2和H3N2 亞型,其中H1N1 SIVs根據(jù)HA 分為經(jīng)典H1N1(Classical H1N1,CSH1N1)SIVs和歐亞類禽H1N1 (Eurasian avian-like H1N1,EAH1N1)SIVs。2009 年,CSH1N1 SIVs、EAH1N1 SIVs與三源重組 H3N2(triple-reassortant H3N2,TRS H3N2)病毒組合,重配產(chǎn)生pdm H1N1/2009,引發(fā)了始于墨西哥的流感大流行。

2 H1N1 SIVs流行病學(xué)現(xiàn)狀

H1N1 SIVs分為CSH1N1 SIVs和EAH1N1 SIVs。CSH1N1 SIVs于1930 年在北美豬群中分離[3],研究顯示1918 年西班牙大流感很可能是由CSH1N1 SIVs造成[4]。1976年,MYERS等[5]檢測發(fā)現(xiàn)美國迪克斯堡至少500 人感染了CSH1N1 SIVs。1979年,比利時等地分離到EAH1N1 SIVs,其與CSH1N1 SIVs相比有明顯的抗原優(yōu)勢。此后,EAH1N1 SIVs逐步替代CSH1N1 SIVs,成為豬群中的優(yōu)勢株[6]。然而,在1988 年,CSH1N1 SIVs與人流感H3N2病毒組合形成雙重組體,該雙重組體進一步與禽流感病毒重組,形成TRS H3N2。此后以上病毒繼續(xù)重組衍生了H1N2,H1N1,H3N1 等三源重組SIVs(triple reassortant internal gene SIVs,TRIG SIVs)[7],見圖1。2001年,EAH1N1 SIVs傳入香港[8],之后在我國豬群普遍流行。2009 年,CSH1N1 SIVs、EAH1N1 SIVs與TRS H3N2病毒組合,形成pdm H1N1/2009,造成全球流感大流行[9]。我國內(nèi)地pdm H1N1/2009最早于2009年在四川發(fā)生,并擴散到全國,此后逐漸平息。陳化蘭等[10]2010－2013年的研究發(fā)現(xiàn),我國豬群中主要流行的是EAH1N1 SIVs。2015年,從湖南省1名肺炎兒童分離到了重組的EAH1N1 SIVs,該病毒基因分別來自EAH1N1、pdm H1N1/2009病毒和CSH1N1 SIVs,在小鼠中表現(xiàn)出更高的傳染性和毒力[11]。2018 年蘇慧娟等[12]研究顯示,我國主要流行的SIVs是H1N1 SIVs,其中主要為EAH1N1 SIVs。此外,PB2、PB1、PA、NP 來自pdm H1N1/2009病毒的EAH1N1 SIVs自2013年后增多,預(yù)測此后可能會出現(xiàn)更多新型重組EAH1N1 SIVs。

圖1 SIVs不同進化譜系的發(fā)展 注：綠色.禽流感譜系；黃色.人流感譜系；淡粉和淡紫.SI譜系；CSH1N1.經(jīng)典H1N1；EAH1N1.歐亞類禽H1N1；TRIG SIVs.三源重組SIVs

3 影響H1N1 SIVs致病性與傳播性的關(guān)鍵氨基酸位點變異

3.1 表面糖蛋白流感病毒外部基因包括血凝素(hemagglutinin,HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,分別編碼促進病毒入侵宿主細胞和新生病毒粒子釋放的糖蛋白。

HA 蛋白是病毒囊膜纖突的主要成分,其功能是結(jié)合宿主唾液酸類受體,輔助病毒吸附細胞。病毒的傳播性與唾液酸受體結(jié)合能力密切相關(guān),唾液酸受體分為ɑ-2,6受體和ɑ-2,3受體,獲得結(jié)合ɑ-2,6受體的能力是實現(xiàn)病毒在哺乳動物間有效傳播的必要條件[13],而127,159,222,223,225,226位的氨基酸與H1N1病毒結(jié)合ɑ-2,6受體的能力緊密相關(guān)[14-20]。研究表明,225E 和225D 分別在EAH1N1 SIVs和CSH1N1 SIVs 的傳播性中發(fā)揮重要作用[21]。陳化蘭等[18]進一步發(fā)現(xiàn),EAH1N1 SIVs的225E能顯著改變病毒在豚鼠中的復(fù)制效率和傳播性。此外,D187E、K211E 和S289N 可使病毒在雪貂中通過空氣傳播[22]。KOEL 等[23]研究顯示153和156位氨基酸顯著影響病毒復(fù)制,156位可能改變pdm H1N1/2009病毒的抗原性,224位氨基酸改變更利于病毒逃逸抗體。糖基化對蛋白質(zhì)有修飾作用,HA 上糖基化位點的位置與數(shù)量決定了病毒抗原性、受體結(jié)合能力和致病力,在pdm H1N1/2009病毒HA 上增加糖基化位點142和177,可增強病毒毒力,減弱對中和抗體的敏感性[24],而119位改變可引導(dǎo)產(chǎn)生潛在的N-糖基化位點,可能導(dǎo)致抗原性改變[25]。S202T 位于HA 蛋白球狀頭部區(qū)域,可能間接影響病毒與宿主細胞的結(jié)合,在C57BL/6J小鼠中,該突變與NP-I133L、I373T 共同加重炎癥反應(yīng)。

NA 蛋白在病毒侵染末期通過催化宿主細胞表面唾液酸受體水解以協(xié)助新生病毒顆粒釋放,在病毒的復(fù)制和傳播過程中有重要作用[26]。目前,首選的抗流感藥物是NA 抑制劑,包括扎那米韋、奧司他韋等。然而隨著NA 抑制劑的廣泛使用,已出現(xiàn)病毒突變產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。已知與耐藥性密切相關(guān)的 位 點 有E119D/G、I223V、S247N、H275Y 和N294S[27-33],其中S247N＋H275Y 雙突變病毒有極高的奧司他韋抗性[31]。最新研究發(fā)現(xiàn)R152K 和R368K 使得病毒對3種NA 抑制劑具有耐藥性表型[34]。此外,NA 活性位點和周圍的殘基突變也可改變病毒對NA 抑制劑的敏感性。例如,V116、I117、E119、Q136、D199和I223位點的變化與季節(jié)性流感和H5N1病毒對NA 抑制劑的敏感性降低有關(guān)[35-40]。INOUE等[41]還發(fā)現(xiàn)了新型NA 缺乏病毒,該病毒NA 基因減少了1 009 nt,缺乏酶域,使病毒對NA 抑制劑產(chǎn)生耐藥性,但并不影響其感染細胞,這類病毒的傳播可能對藥物治療造成威脅。

3.2 RNA 聚合酶相關(guān)蛋白流感病毒的RNA 聚合酶由PB2、PB1、PA 組成,行使病毒RNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制功能。

PB2亞基能識別細胞m RNA 的5′端帽結(jié)構(gòu),并具有3′→5′的核酸內(nèi)切酶活性。研究顯示PB2蛋白能夠影響病毒宿主范圍和致病力。在小鼠模型中,E158G 顯著增強病毒復(fù)制和致病力,甚至研究發(fā)現(xiàn)E158G 對pdm H1N1/2009病毒RNA 復(fù)制和發(fā)病機制的影響要比PB2-E627K 大得多,推測E158G 可能在禽類PB2基因適應(yīng)哺乳動物的過程中起重要作用[42]。BUSSEY 等[43]研究顯示能增強聚合酶活性,促進病毒在哺乳動物細胞中生長,MA等[44]進一步發(fā)現(xiàn)271A 可彌補627E 降低病毒致病性的缺陷,可能有助于pdm H1N1/2009病毒的傳播以及跨物種傳播。此外,588I也增強了病毒聚合酶活性以及對小鼠的致病性[45]。627K 可增強病毒的復(fù)制和對小鼠的毒力,是毒株致病力增強的標(biāo)志[44]。701 N 會增強病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制和致病性,是流感病毒可在哺乳動物中復(fù)制和傳播的標(biāo)志[46]。

PB1蛋白促使病毒m RNA 合成起始后逐漸延長。目前與PB1位點突變相關(guān)的研究較少。最近研究顯示,T296R 增強了病毒復(fù)制和聚合酶活性,以及pdm H1N1/2009 病毒對小鼠的毒性[47]。A469T 也顯著增強聚合酶活性,與NS1-N205K 和NEP-T48N 的組合被認為是病毒能夠在豚鼠中傳播的決定因素[48]。KO?ER 等[49]發(fā)現(xiàn)PB1的4個殘基H15R、N23S、T27I和H75L,通過殘基效應(yīng)和宿主效應(yīng)與小鼠的致病性相關(guān)。

PA 蛋白是一種磷酸化蛋白,其功能尚不清楚。僅有劉金華等[50]研究顯示,A70V 和P224S參與了病毒的致死表型,在病毒復(fù)制和人群傳播中有選擇性優(yōu)勢,兩者聯(lián)合突變顯著提高了病毒致死率,加重肺臟的病理變化。P224S位于核定位信號域,可能影響PA 在病毒感染細胞的細胞核中的運輸和積累[51]。這些突變導(dǎo)致病毒致病性增強的機理仍需要進一步研究。

3.3 核蛋白NP 蛋白負責(zé)與病毒RNA 結(jié)合,形成核糖核蛋白復(fù)合物,同時參與復(fù)合物的入核、出核以及病毒復(fù)制,為誘導(dǎo)宿主細胞免疫應(yīng)答的主要成分。DANZY 等[52]發(fā)現(xiàn),3種(PB2-Q236H,E627K,NP-N309K)或2種(PB2-Q591K、NP-S50G)突變的最小組合,可使病毒在人類支氣管上皮細胞有效生長,說明NP 蛋白與其他蛋白有協(xié)同作用。100 位氨基酸位于表面多氨基酸簇內(nèi),對人類Mx A GTP酶具有耐藥性,V100I 有助于病毒在小鼠中復(fù)制[53]。此前,GíRIA 等[54]已證實V100I是促進病毒在人與禽間傳播的重要變化。I133L 和I373T 位于NP和PB2的結(jié)合域中[55],都能增強病毒對小鼠的致病性[53]。pdm H1N1/2009 病毒在小鼠肺部連續(xù)傳代后適應(yīng)宿主,出現(xiàn)NP-I353V 和其他蛋白突變,對小鼠的致死率達到100%[56]。此外,D375N大大增強A/California/04/09的毒力,可能改變宿主范圍,特別是從鳥類到哺乳動物的改變[14]。

3.4 基質(zhì)蛋白及離子通道蛋白病毒的第7節(jié)段編碼基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2,組成病毒基質(zhì)蛋白層,其中M2蛋白是烷胺類抗流感藥物的靶點[26],目前針對M 蛋白的研究多與耐藥性相關(guān)。研究顯示,M2 的L26F、V27A、A30T、S31N、G34E這些位點只要有一個或以上的變異就會導(dǎo)致耐藥毒株的出現(xiàn)[57]。CAMPBELL 等[58]發(fā)現(xiàn),pdm H1N1/2009病毒的M 片段增強了神經(jīng)氨酸酶活性,隨著活性變化,M 片段可影響病毒粒子的形態(tài)和在豚鼠中的傳播能力。

3.5 非結(jié)構(gòu)蛋白NS蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白,包括NS1和NS2,與RNA 出核和拮抗宿主抗病毒反應(yīng)相關(guān)。NS1的S/T7L和E227G通過殘基效應(yīng)和宿主效應(yīng)與病毒致病性相關(guān)[49]。I123V位于蛋白激酶結(jié)合位點,可能提高病毒表達[59],還可能增強病毒致病性,促進病毒適應(yīng)人類[54]。病毒在小鼠中連續(xù)傳代后獲得適應(yīng)性突變G159E,可增強病毒對小鼠的致病性[56]。NS1蛋白C-末端的4個殘基是病毒的致病因子,有大量研究與其相關(guān)。研究顯示KSEV 取代C-末端可以加重肺部形態(tài)學(xué)病變[60]。GSEI和EPEV 與病毒毒性相關(guān),可促進病毒跨越物種屏障[61]。ESEV、EPEV可增強病毒對小鼠的毒力[62]。由此可見,C-末端殘基與病毒致病性密切相關(guān)。

綜上所述,豬呼吸道上皮存在2種唾液酸受體,是流感病毒的混合器,所以人/豬/禽流感病毒均可感染豬,且容易在豬體內(nèi)重組或突變,進而改變病毒特性。值得注意的是,某些氨基酸位點改變會導(dǎo)致病毒致病性或傳播性變化,使得H1N1 SIVs跨宿主傳播成為可能。如表1所示,我們對H1N1 SIVs的氨基酸突變進行了分類總結(jié)。

4 總結(jié)

眾所周知,流感病毒的生物學(xué)特性是由不同基因片段組合產(chǎn)生的多基因性狀。我國H1N1 SIVs中存在多樣性和復(fù)雜性,病毒常出現(xiàn)基因重組或突變,導(dǎo)致相應(yīng)特性改變。例如,某些氨基酸替換或增減可能通過改變蛋白質(zhì)功能以及蛋白質(zhì)之間的相互作用,進而改變病毒的致病性和傳播性。隨著H1N1 SIVs不斷進化,感染人的現(xiàn)象多有發(fā)生,我國對H1N1 SIVs的研究仍需深入,以了解和監(jiān)測H1N1 SIVs的變異、傳播和潛在危害。病毒的HA蛋白結(jié)合宿主唾液酸受體,輔助病毒吸附細胞,影響病毒宿主范圍；NA 蛋白識別唾液酸殘基,介導(dǎo)病毒進出細胞,影響病毒耐藥性；PB2蛋白識別和切割宿主m RNA 5′端帽結(jié)構(gòu),影響病毒的宿主范圍和致病力；NP蛋白是誘導(dǎo)宿主細胞免疫應(yīng)答的主要成分,影響病毒的復(fù)制與毒力；NS1蛋白主要影響宿主免疫調(diào)控,提高病毒致病性。目前對于以上5種蛋白的研究較為深入,而對于其他蛋白包括PB1-F2、PA-X 等輔助蛋白的作用機制仍需進一步探討,這方面的研究將成為研究H1N1 病毒致病性與傳播性分子機制的新突破點。

表1 H1N1 SIVs關(guān)鍵氨基酸位點變異導(dǎo)致的生物學(xué)特性改變