氫化可的松對(duì)保存過(guò)程中豬精子的影響

孫歡歡,王 娜,孫良振,郭海濤,王婧然,楊 康,周佳勃,譚景和,2? (.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱50030；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山東 泰安2708)

近年來(lái),隨著工作壓力的激增、生活節(jié)奏的加快、就業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的激烈,多種多樣的應(yīng)激原浮現(xiàn)在我們的日常生活中,應(yīng)激的增加逐漸成為多種生理功能障礙的誘因,甚至能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明,應(yīng)激是對(duì)雄性生育能力最有影響力的因素之一[1]。

應(yīng)激會(huì)增強(qiáng)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的活動(dòng),并且促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素。應(yīng)激狀態(tài)下的小鼠血清皮質(zhì)酮從0.1 mg/L 顯著升高到0.2～1.0 mg/L[2]；皮 質(zhì) 醇 從0.01 mg/L 升 高 到0.05 mg/L[2-3],促腎上腺皮質(zhì)激素可顯著提高母豬皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度[4]。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)參與調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程,包括能量代謝、炎癥、免疫、生長(zhǎng)、滲透調(diào)節(jié)、神經(jīng)元功能和動(dòng)物行為等[5]。在體內(nèi),應(yīng)激水平的血漿GC 質(zhì)量濃度能顯著增加青春期和成年期大鼠生精細(xì)胞凋亡比例。在皮質(zhì)醇增多綜合征中,高質(zhì)量濃度GC 也是與生精障礙和無(wú)精癥密切有關(guān)。試驗(yàn)表明,外源性GC 引起的生殖細(xì)胞的凋亡可完全被糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)拮抗劑所抑制,所以GC可能是通過(guò)GR 調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄基因直接作用于生精細(xì)胞的,但其機(jī)制還不清楚。

GC對(duì)精子影響的研究主要集中于精子發(fā)生階段,主要在體內(nèi),但是體內(nèi)環(huán)境是受多因素共同作用的,不同條件下得到的試驗(yàn)結(jié)果存在差異。有報(bào)道認(rèn)為口服低劑量可的松或氫化可的松是一種有望治療少精子癥的方法[6-7]。然而,也有報(bào)道表明采用該方法對(duì)患有先天性不育的男性進(jìn)行治療并沒(méi)有提高患者精子的受精能力也沒(méi)有增加患者精子總數(shù)或精子活率[8]。因此,本研究以體外保存過(guò)程中的豬精子為研究對(duì)象,排除體內(nèi)復(fù)雜因素的干擾,旨在進(jìn)一步探討GC對(duì)豬精子是否存在影響,為降低應(yīng)激,以及GC對(duì)雄性動(dòng)物生殖的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑除特殊說(shuō)明外,本研究所用試劑均來(lái)自Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

BTS稀釋液作為保存液,其包含205.37 mmol/LD-葡萄糖,20.40 mmol/L 二水檸檬酸鈉,3.69 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉,14.88 mmol/L 碳酸氫鈉,10.06 mmol/L 氯化鉀,50 IU/m L 青霉素鈉,0.1 g/L 硫酸鏈霉素；p H 7.2。

1.2 精液采集與保存精液采自5頭健康可育長(zhǎng)白種公豬,用手握法采集富精期的濃精液。將采集的鮮精液溫度保持在35℃,30 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。鏡檢精子活力≥80%以上的精液樣品用于試驗(yàn)。鮮精液避光置于室溫2 h使溫度緩慢降至室溫,將精液按稀釋比例分裝于15 m L的離心管中,離心去除精漿；然后分別用含有不同質(zhì)量濃度(0.1,0.25,0.5,10.0,50.0 mg/L)氫化可的松、50μmol/L米非司酮以及氫化可的松和米非司酮聯(lián)合作用的保存液稀釋,不含氫化可的松的處理作為對(duì)照組,分裝至1.8 m L 凍存管中,使精子的終濃度為3×107～5×107個(gè)/m L。將含有不同處理的凍存管置于17℃恒溫箱中保存5 d,每隔24 h取精液樣本并檢測(cè)。

1.3 精子活力檢測(cè)在檢測(cè)前將精子樣本混勻并放到37℃恒溫箱中預(yù)熱20 min,使用清華同方精子分析儀(MX 7.5)分析精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取10μL預(yù)熱后的精子樣本涂于計(jì)數(shù)池上,每次檢測(cè)6個(gè)視野,精子數(shù)量不少于200個(gè)。

1.4 精子蛋白的Western blot分析取1 m L 精液,1 500 r/min離心10 min,棄上清,并用PBS洗滌2次,每次10 min；離心后的沉淀重懸于含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中,并進(jìn)行超聲處理,處理后的樣品在冰上裂解40 min。將等量的蛋白質(zhì)煮沸10 min,然后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將PVDF 膜用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,一抗4℃孵育過(guò)夜。次日,用PBST 緩沖液洗去一抗后用山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。PBST 緩沖液洗去二抗后用ECL Plus蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)顯示印跡。β-actin(1∶1 000,＃M20615,TransGen Biotech)；GR(1∶1 000,＃ WL02695,Wanleibio)。

1.5 精子免疫熒光檢測(cè)取1 m L 精液,1 500 r/min離心5 min,棄上清并用PBS洗滌2次,然后取60μL 細(xì)胞懸液加入到200μL 溫?zé)岬腜BS 中,1 500 r/min 離心5 min；棄上清,沉淀重懸于200μL 4%多聚甲醛中,固定30 min后,去除多聚甲醛并用200μL含0.1%Triton X-100的PBS緩沖液通透20 min,并對(duì)GR 進(jìn)行免疫熒光染色處理。然后用含10%正常牛血清(BSA)的PBS緩沖液室溫封閉1 h后,使用兔多克隆抗GR 作為一抗,FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG 作為二抗孵育同上。在倒置熒光顯微鏡下觀察。GR(1∶200,＃ WL02695,Wanleibio)。

1.6 精子DNA 完整性的檢測(cè)根據(jù)VIRANT等[9]報(bào)道的方法,取20μL精子懸液涂于載玻片上。風(fēng)干后,在Carnoy溶液(甲醇/醋酸,3∶1)中固定過(guò)夜。沖洗風(fēng)干后,將載玻片用新鮮制備的吖啶橙(AO)染色劑染色5 min,洗滌干燥后,立即在倒置熒光顯微鏡400倍下觀察。具有染色質(zhì)完整的精子頭部呈現(xiàn)綠色熒光,具有染色質(zhì)變性(DNA 不完整)的精子頭部呈現(xiàn)橙紅或黃色熒光。

1.7 精子線粒體膜電位的檢測(cè)采用MitoProbe JC-1試劑盒對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)[10]。取0.5 m L 精子數(shù)量為2×106個(gè)精子的樣品,加入0.5 m L JC-1染色工作液,顛倒數(shù)次混勻。在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。37℃孵育結(jié)束后,4℃下1 000 r/min離心5 min。再用JC-1緩沖液(1×)重懸后,涂片,倒置熒光顯微鏡400倍下觀察。

1.8 精子凋亡的檢測(cè)精子凋亡水平采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)[11]。測(cè)時(shí),先將1 m L 精液1 500 r/min離心5 min,棄上清,再用0℃的PBS重懸并計(jì)數(shù)。將精子(1×106)重懸于500μL 的結(jié)合緩沖液中,并與10μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 一 起 避 光 室 溫 孵 育20 min,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量凋亡率(%)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s x) 表示。每個(gè)試驗(yàn)處理至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 氫化可的松對(duì)保存過(guò)程中精子活力的影響

如圖1可知,在保存豬精液過(guò)程中各組活力均隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。0.1 mg/L 氫化可的松處理組與對(duì)照組(0.0 mg/L)差異不顯著。0.25～50.0 mg/L 從保存第1天起與對(duì)照組和0.1 mg/L組精子活力出現(xiàn)差異,且隨著氫化可的松作用時(shí)間的延長(zhǎng)精子活力顯著降低(P＜0.05)。高質(zhì)量濃度的氫化可的松組(10.0～50.0 mg/L)精子活力下降幅度更大,顯著高于對(duì)照組。

圖1 不同質(zhì)量濃度的氫化可的松對(duì)精子活力的影響 注：所標(biāo)字母不同者表示差異顯著(P＜0.05)

2.2 GR在豬精子中的表達(dá)采用Western blot方法檢測(cè)射出的豬精子是否存在GR 的表達(dá),結(jié)果如圖2所示,5頭不同公豬射出的精子混合樣品都檢測(cè)到了GR 蛋白的表達(dá),相對(duì)分子質(zhì)量95 000,其中用小鼠精子作為陽(yáng)性對(duì)照。

圖2 豬精子蛋白的Western blot分析 P1,P2.混合樣品；Ms.小鼠精子陽(yáng)性對(duì)照；β-actin.上樣對(duì)照

圖3 豬射出的精子中GR 的免疫定位 A.光鏡下的豬精子；B.GR 在豬精子中的表達(dá)(400×)

采用免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步研究GR 的在豬精子上的定位,如圖3所示GR 主要表達(dá)在豬精子頂體后區(qū)及尾部中段線粒體鞘周?chē)?而尾部其余部分未見(jiàn)信號(hào)；提示GR 受體可能在氫化可的松作用精子過(guò)程中起作用。

2.3 米非司酮與氫化可的松聯(lián)合作用對(duì)精子活力的影響米非司酮是GR 的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。采用50μmol/L米非司酮抑制GR,結(jié)果如圖4所示,米非司酮可有效拮抗氫化可的松的作用,精子保存第5天時(shí)氫化可的松＋米非司酮處理組精子活力顯著高于氫化可的松單獨(dú)處理組(P＜0.05),與對(duì)照組差異不顯著。近一步證實(shí)氫化可的松可能是通過(guò)其受體作用于精子的。

2.4 氫化可的松對(duì)體外精子DNA碎裂(DFI),線粒體膜電位(MMP)和細(xì)胞凋亡的影響在添加或不添加50μmol/L米非司酮的條件下,用0.25 mg/L氫化可的松體外保存豬精液5 d后檢測(cè)氫化可的松對(duì)DFI,MMP以及精子細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)DNA 碎片指數(shù)(DFI)的影響：氫化可的松處理組精子DFI(23.77±1.17)%顯著高于對(duì)照組(12.50±1.54)%(P＜0.05),氫化可的松＋米非司酮處理組(13.84±1.67)% 與對(duì)照組差異不顯著。

精子線粒體膜電位(MMP)影響：氫化可的松處理組精子MMP(27.19±1.55)%顯著低于對(duì)照組(59.51±2.09)%和與米非司酮聯(lián)合處理組(58.92±1.55)%,而后2組差異不顯著。

圖4 米非司酮與氫化可的松聯(lián)合作用對(duì)豬精子活力的影響 注：同列數(shù)據(jù)所標(biāo)字母不同者表示差異顯著(P＜0.05)。下同

對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：氫化可的松促進(jìn)精子細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡比例顯著高于對(duì)照組及與米非司酮聯(lián)合處理組。

表1 氫化可的松對(duì)體外精子DFI、MMP和精子凋亡的影響 %

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)會(huì)促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素(GC),長(zhǎng)期處于高水平GC 的作用下能夠損傷生精上皮,導(dǎo)致生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞間隙擴(kuò)大,生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損,影響生殖細(xì)胞的正常功能,雄激素合成減少,精子發(fā)生障礙[12]。然而GC 對(duì)射出的成熟精子是否有影響還有待于研究。事實(shí)上,哺乳動(dòng)物精子在雄性和雌性生殖道中的遷移過(guò)程,生殖道為它們提供了一個(gè)與各種激素相互作用的機(jī)會(huì)。許多的研究表明哺乳動(dòng)物雄性和雌性生殖道中存在大量類固醇激素[13]。為了減少體內(nèi)多種因素的干擾,本研究采用BTS為豬精液稀釋液,在該稀釋液中17℃保存7 d的豬精液,仍可穩(wěn)定維持活力60%以上[14],為研究GC對(duì)精子的影響提供了一個(gè)比較適宜的研究體系。有報(bào)道表明血清中GC 的生理質(zhì)量濃度約為0.1 mg/L[15-17]；應(yīng)激狀態(tài)下豬血清中皮質(zhì)醇的質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg/L[18]。因此本研究中采用的氫化可的松的質(zhì)量濃度分別為0.1,0.25,0.5,10.0 和50.0 mg/L。結(jié)果表明,生理質(zhì)量濃度0.1 mg/L 氫化可的松對(duì)豬精子活力影響不大,但是應(yīng)激質(zhì)量濃度0.25,0.5 mg/L氫化可的松處理組可降低精子的活力,特別是長(zhǎng)期作用下精子活力顯著降低。而高質(zhì)量濃度的氫化可的松組(10.0～50.0 mg/L)精子活力下降幅度更大。

GC需要結(jié)合到糖皮質(zhì)激素受體(GR)形成復(fù)合體后,在熱休克蛋白的作用下進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi),作用于下游轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究表明小鼠成熟精子存在GR 的表達(dá)[19],豬的射出精子是否表達(dá)GR 如何定位尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中采用Western blot和免疫熒光的方法進(jìn)行定位及定量的研究,證明豬精子存在GR 的表達(dá),而且集中表達(dá)在豬精子頂體后區(qū)及尾部中段線粒體鞘周?chē)?而尾部其余部分未見(jiàn)信號(hào),提示GC 很可能通過(guò)GR 起作用,而且很有可能影響精子線粒體功能。采用GR抑制劑米非司酮可拮抗氫化可的松作用,進(jìn)一步證實(shí)了我們的猜想。體外保存5 d,與對(duì)照組相比0.25 mg/L氫化可的松可顯著降低精子活力,而米非司酮與氫化可的松聯(lián)合作用組精子活力與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

為了進(jìn)一步研究氫化可的松對(duì)精子的影響,采用0.25 mg/L的氫化可的松體外保存豬精液5 d后檢測(cè)氫化可的松對(duì)DFI、MMP 以及精子細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,長(zhǎng)期應(yīng)激質(zhì)量濃度的氫化可的松處理組DFI顯著提高,MMP降低,細(xì)胞凋亡比例提高,米非司酮可有效拮抗氫化可的松的作用,表明氫化可的松可能是通過(guò)與其受體GR 結(jié)合,干擾線粒體功能從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TOME 等[20]報(bào)道,合成的GC地塞米松會(huì)誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡且線粒體是該凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的核心。這些結(jié)果進(jìn)一步證明GC可能間接啟動(dòng)線粒體凋亡通路來(lái)影響豬精子。

綜上所述,保存過(guò)程中添加0.25 mg/L 氫化可的松開(kāi)始會(huì)降低精子活力影響精液質(zhì)量。添加50μmol/L 米非司酮可拮抗氫化可的松的作用提高精子活力。在長(zhǎng)期(5 d)應(yīng)激質(zhì)量濃度氫化可的松作用下,精子DFI增加,線粒體功能下降,凋亡比例增加,這些作用可以被米非司酮拮抗。表明氫化可的松可能是通過(guò)與其受體GR 結(jié)合干擾線粒體功能從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為降低應(yīng)激,以及GC對(duì)雄性動(dòng)物生殖的影響提供理論參考。