雌二醇和孕酮對(duì)綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞形成的影響

張 潔,王多智,王曉娟,劉淑英 (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018)

妊娠是動(dòng)物繁衍過(guò)程中所必須經(jīng)歷的一個(gè)階段,這種生理狀態(tài)是由各種生殖激素進(jìn)行調(diào)控的,如蛻膜化、植入和分娩,同時(shí)也為母體代謝適應(yīng)和泌乳做出調(diào)節(jié)[1]。胎盤(pán)的形成和發(fā)育在妊娠期間起著至關(guān)重要的作用[2-3],而不同物種的胎盤(pán)結(jié)構(gòu)也不同[4],綿羊的胎盤(pán)結(jié)構(gòu)屬于子葉型胎盤(pán),從微觀組織學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于結(jié)締組織絨毛膜胎盤(pán),其特點(diǎn)是包含多個(gè)由絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(STCs)和子宮肉阜組成的胎盤(pán)瘤[5]。其中一些滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生分化,形成兩個(gè)細(xì)胞核的滋養(yǎng)層細(xì)胞,它們稱為巨細(xì)胞或雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophoblast binucleate cells,TBCs),同時(shí)它們?cè)谡麄€(gè)妊娠期的不同階段與子宮內(nèi)膜細(xì)胞融合[6]。由子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞(ELECs)與TBCs相互融合產(chǎn)生多核細(xì)胞團(tuán)稱為合胞體[7],是哺乳動(dòng)物特有的結(jié)構(gòu),這些多核細(xì)胞團(tuán)能夠?qū)⒓に睾妥甜B(yǎng)層細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到母體循環(huán)中[8]。在大多數(shù)情況下,無(wú)法證明每個(gè)胎盤(pán)激素直接參與妊娠過(guò)程,因?yàn)檫@些激素在每一個(gè)空間和時(shí)間上都受到若干因素的嚴(yán)格調(diào)節(jié),包括通過(guò)其他胎盤(pán)激素的間接作用。因此,胎盤(pán)激素水平的改變可能對(duì)不同的妊娠過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響,并與不良妊娠有關(guān),而這些激素的缺乏也可能導(dǎo)致胎盤(pán)發(fā)育的改變[9]。

張微惠等[10]研究發(fā)現(xiàn),人類妊娠早期血清孕酮(P4)由卵巢黃體和妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌合成的,而妊娠8周后主要來(lái)自胎盤(pán),妊娠12周后胎盤(pán)完全形成,血清P4水平將會(huì)迅速升高,因此妊娠12 周以前,血清P4的水平是穩(wěn)定而且不依賴于孕齡的。BUKOVSKY 等[11]研究發(fā)現(xiàn),在人足月胎盤(pán)中有雌激素受體m RNA 的表達(dá),雌二醇(E2)通過(guò)雌激素受體ERα增強(qiáng)人原代滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化。陳誠(chéng)等[12]研究發(fā)現(xiàn),胎盤(pán)內(nèi)分泌異常會(huì)引起疾病的發(fā)生,并且在妊娠期間使用藥物也會(huì)影響胎盤(pán)內(nèi)分泌造成不良妊娠的結(jié)果。

近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道中,缺少激素對(duì)于絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞作用的數(shù)據(jù),但可以推測(cè)激素的參與對(duì)于絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞及胎盤(pán)發(fā)育有著非常重要的影響。為此本試驗(yàn)采用E2和P4對(duì)已建立的STCs和ELECs共培養(yǎng)體系進(jìn)行刺激,設(shè)置不同的濃度組來(lái)觀察激素對(duì)于絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的形成扮演了什么樣的角色。為了進(jìn)一步探究絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的形成與生殖激素的關(guān)系,本試驗(yàn)設(shè)立了激素聯(lián)合組,從而佐證單激素刺激和聯(lián)合激素刺激的結(jié)果是否一致,進(jìn)一步探究影響絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞形成的因素,也為綿羊胚胎發(fā)育的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源妊娠45～60 d的健康綿羊子宮及胎盤(pán)組織由呼和浩特市某屠宰場(chǎng)提供。

1.2 主要試劑E2、P4均購(gòu)自Sigma公司；D-PBS購(gòu)自Hyclone公司；DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；姬姆薩染色液購(gòu)自索萊寶公司。

1.3 STCs和ELECs共培養(yǎng)體系的建立本試驗(yàn)所用的原代綿羊STCs和ELECs的培養(yǎng)、鑒定及其培養(yǎng)體系的建立,參照文獻(xiàn)[13]。

1.4 E2和P4工作濃度的摸索將E2和P4的濃度用DMEM 培養(yǎng)基稀釋為10－6,10－7,10－8,10－9mol/L,在最佳共培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)D-PBS進(jìn)行清洗后,將不同濃度激素按照每孔1 m L 的量進(jìn)行刺激,37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,用5%多聚甲醛進(jìn)行固定和染色,在顯微鏡下觀察滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的數(shù)量,每組做3次平行試驗(yàn)。

1.5 E2和P4聯(lián)合觀察根據(jù)試驗(yàn)所得到的E2和P4工作濃度,進(jìn)行E2和P4聯(lián)合作用的觀察,每組重復(fù)3次,使用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。設(shè)置試驗(yàn)分組如下：?jiǎn)渭に卮碳?E2和P4分別刺激4 h組；雙激素刺激,E2和P4共同刺激4 h組；聯(lián)合刺激組,先E2刺激2 h,再P4刺激2 h組；先P4刺激2 h,再E2刺激2 h組；空白對(duì)照組,不加任何激素,換液4 h后觀察。

1.6 姬姆薩染色法將12孔板中的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后,用4%多聚甲醛固定20～25 min；PBS清洗3次,每次5 min；把姬姆薩濃縮液和稀釋液按照1∶9的比例配置為姬姆薩染色工作液,每孔加入1 m L的染色工作液,搖床上常溫染色30～35 min,自來(lái)水沖洗,并用濾紙吸干晾干。

1.7 數(shù)據(jù)分析不同濃度的E2和P4組的絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量采用GraphPad Prism 5 軟件ANOVA 程序進(jìn)行顯著性比較(P＜0.05),結(jié)果以±s形式表示。聯(lián)合組的結(jié)果也以±s形式表示。

2 結(jié)果

2.1 絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的形態(tài)觀察在倒置顯微鏡下,可以觀察到絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞大多呈不規(guī)則形(圖1),邊緣不整齊,有些呈煎蛋樣,細(xì)胞形態(tài)較其他細(xì)胞大且細(xì)胞質(zhì)豐富圓潤(rùn),細(xì)胞核多呈橢圓形或圓形,數(shù)量在3個(gè)以上,且不靠近細(xì)胞中央,位于細(xì)胞的一側(cè)。圖中箭頭所示為絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞。

2.2 E2 最佳工作濃度的確立將E2按照10－6,10－7,10－8,10－9mol/L的濃度進(jìn)行稀釋,均刺激4 h后,滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的數(shù)量隨著E2濃度的升高,滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的數(shù)量表現(xiàn)出先增多后減少的趨勢(shì),而當(dāng)E2濃度為10－7mol/L時(shí),細(xì)胞的多核數(shù)量相對(duì)最多；細(xì)胞融合率的結(jié)果與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果相一致(表1)。

圖1 倒置顯微鏡下絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的形態(tài)(×200) 左.4核；右.3核

表1 不同濃度E2對(duì)絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的影響

2.3 P4 最佳工作濃度的確立將P4按照10－6,10－7,10－8,10－9,10－10,10－11,10－12,10－13mol/L的濃度進(jìn)行稀釋,均刺激4 h后,滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的數(shù)量隨著P4濃度的升高表現(xiàn)出先減少后增多又逐漸減少的趨勢(shì),而當(dāng)P4濃度為10－7mol/L 時(shí),細(xì)胞的多核數(shù)量相對(duì)最多,細(xì)胞融合率的結(jié)果與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果相一致(表2)。

2.5 E2 和P4 聯(lián)合使用結(jié)果根據(jù)試驗(yàn)所得到E2和P4的工作濃度,進(jìn)行E2和P4聯(lián)合作用的觀察,其結(jié)果如下：E2的加入相對(duì)于空白組引起綿羊滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的增加,而P4的加入相對(duì)于空白組則不同程度的引起滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的減少,聯(lián)合組的結(jié)果與E2和P4單刺激的結(jié)果趨勢(shì)一致(表3)。

表2 不同濃度P4 對(duì)絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的影響

表3 不同激素對(duì)絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的影響

3 討論

妊娠期最典型的特征就是激素水平的急劇變化。在此期間,由胎盤(pán)合成和分泌的一些激素調(diào)節(jié)著妊娠的不同階段[14],而在胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,同時(shí)也受到各種生殖激素的調(diào)控,在整個(gè)妊娠期間雌激素和孕激素是變化幅度最大的[15-16]。因此本試驗(yàn)以E2和P4對(duì)建立的STCs和ELECs共培養(yǎng)體系進(jìn)行刺激,設(shè)置不同的濃度組以此來(lái)觀察激素濃度對(duì)絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的影響,進(jìn)一步探究影響絨毛膜滋養(yǎng)層多核細(xì)胞形成的因素。

彭秀梅[17]從牦牛輸卵管上皮細(xì)胞中克隆了牦牛OPN 基因,OPN 會(huì)促進(jìn)受精和胚胎發(fā)育；早期黃體階段牛的輸卵管上皮細(xì)胞中OPN 的表達(dá)水平最高；而E2可以抑制小鼠血管平滑肌中OPN 的表達(dá)；P4可促進(jìn)小鼠皮膚細(xì)胞OPN 表達(dá),但是加入E2后其表達(dá)有所下降；在羊發(fā)情周期子宮中均可檢測(cè)到OPN,但不同時(shí)期其表達(dá)水平有所不同,這可能與發(fā)情周期的不同階段其激素含量不同有關(guān)；證明E2、P4對(duì)于不同哺乳動(dòng)物輸卵管上皮細(xì)胞的調(diào)控可能存在物種差異性。而劉麗珍等[18]研究發(fā)現(xiàn),蒙古綿羊的P4水平,在妊娠2 d為0.4μg/L,然后升高,在妊娠8～16 d維持在8.3μg/L 左右,而在妊娠19～30 d P4水平有所下降,30 d為2.5μg/L；表明P4在綿羊妊娠過(guò)程隨著妊娠周期的不同而逐漸變化,同時(shí)也證明P4對(duì)不同哺乳動(dòng)物的生理調(diào)控也可能存在物種差異性。

張磊等[19]結(jié)果表明P4會(huì)促進(jìn)犬子宮組織炎癥損傷及促炎因子分泌,其病變嚴(yán)重程度、病程與P4使用劑量和持續(xù)時(shí)間有關(guān)；雌激素則降低相關(guān)炎癥因子產(chǎn)生,且低濃度的雌激素可以增加子宮對(duì)P4的敏感性；說(shuō)明犬子宮炎癥發(fā)生過(guò)程中P4促進(jìn)疾病的發(fā)生,雌激素卻可以有效地保護(hù)子宮組織,降低炎癥損傷。梁宇翔等[20]研究表明過(guò)量的P4會(huì)抑制小鼠子宮的蛻膜化,并可能影響人的蛻膜化過(guò)程。本試驗(yàn)結(jié)果表明,雌激素的加入會(huì)造成綿羊滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的增加,而孕激素的加入則引起了滋養(yǎng)層多核細(xì)胞數(shù)量的減少,與上述的人和牦牛的妊娠早期結(jié)果不一致,而與綿羊妊娠早期和激素引起犬發(fā)生子宮組織炎癥的結(jié)果一致?？梢圆聹y(cè)在妊娠的不同階段激素所承擔(dān)的功能是不同的所以含量也是不同的,且存在物種的差異性。而本試驗(yàn)主要探討了妊娠中期,胎盤(pán)已經(jīng)成熟,滋養(yǎng)層細(xì)胞是孕激素的主要來(lái)源,因此本試驗(yàn)添加孕激素反而違背了正常動(dòng)物機(jī)體內(nèi)孕激素的水平,從而抑制了滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng),造成滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的減少；相反,添加P4會(huì)促進(jìn)疾病的發(fā)生,因此造成滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的減少,而雌激素卻可以有效地保護(hù)子宮組織、降低炎癥損傷,因此引起滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的增多。

王含必等[21]研究發(fā)現(xiàn),在體外培養(yǎng)的人黃體細(xì)胞中加入低濃度E2能直接刺激孕激素產(chǎn)生,而當(dāng)加入過(guò)量的E2時(shí),則明顯抑制孕激素產(chǎn)生。所以當(dāng)E2、P4比例不合適,過(guò)量的E2干涉孕激素的作用會(huì)影響子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化,而低濃度的E2可以增加子宮對(duì)P4的敏感性。因此雌激素及孕激素之間理想的平衡狀態(tài)是保證早期正常妊娠的必要條件。本試驗(yàn)研究表明,先加入E2刺激再加入P4,滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的數(shù)量與只加E2試驗(yàn)組明顯增多,且均高于空白對(duì)照組；而先加入P4刺激再加入E2,滋養(yǎng)層多核細(xì)胞的數(shù)量與E2＋P4組,只加P4試驗(yàn)組相比也明顯增多,且E2＋P4組和之加P4試驗(yàn)組均低于空白對(duì)照組,該試驗(yàn)結(jié)果的趨勢(shì),與上述結(jié)果一致。本試驗(yàn)為綿羊胚胎發(fā)育機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。