多花黃精種子萌發(fā)過程的形態(tài)和解剖研究

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(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)是中藥材黃精(PolygonatiRhizoma.)的基源植物之一，用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少、肺虛燥咳、勞嗽咳血、精血不足、腰膝酸軟、須發(fā)早白和內(nèi)熱消渴等方面[1]。多花黃精主產(chǎn)于貴州、湖南、云南、浙江、安徽等省[2]。近年來，黃精因其獨(dú)特的藥食同源性質(zhì)而具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場對黃精原料的需求量日益增加[3]，野生資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場需求[3]。多花黃精人工栽培中通常用塊莖進(jìn)行無性繁殖。長期的無性繁殖導(dǎo)致黃精品種質(zhì)量的惡化[4]。利用種子進(jìn)行有性繁殖成為解決品種質(zhì)量惡化的有效方法，但因其種子萌發(fā)周期長，要經(jīng)歷2個(gè)冬季休眠才能長出第1片真葉，導(dǎo)致人工大規(guī)模種子育苗遇到困難[5-6]。

黃精(PolygonatumsibiricumRed.)、多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)與滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)同屬百合科黃精屬植物。百合科藥用植物種子質(zhì)地堅(jiān)硬,有許多種的種子存在休眠現(xiàn)象[7]。黃精種子具有形態(tài)生理休眠的特性[8]。滇黃精種子具有形態(tài)休眠特性[9]。但是關(guān)于多花黃精種子休眠原因的研究較少，因此有必要了解多花黃精種子萌發(fā)過程中的形態(tài)變化及解剖特征，為解除其種子休眠及促進(jìn)種子萌發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2018年10月下旬采自貴州大禹王農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司黃精種植基地，種植年限為5年，經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)院趙財(cái)副教授鑒定為多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua.。清水中洗去外種皮，在陰處晾干水分，備用。

1.2 方 法

1.2.1種子處理

種子4 ℃沙藏4個(gè)月以后洗凈，置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，潤濕濾紙，放入人工氣候箱中黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為28 ℃。

1.2.2種子萌發(fā)過程形態(tài)觀察

在低溫沙藏過程中，每隔1月測定多花黃精種子百粒重；選取每個(gè)階段種子50粒測定種子長、寬、厚；選取各階段種子30粒測量胚長和胚乳長，計(jì)算胚率(胚率=胚長/胚乳長)，胚長與胚乳長在Nikon-SMZ 800體式顯微鏡下測量；種子縱徑和橫徑用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量。從種子露白開始，每天觀察、照相，每隔1 d定株觀察并拍照種子從胚露白到初生根莖形成的形態(tài)變化過程。

取萌發(fā)過程中形態(tài)變化大的種子制作石蠟切片。具體步驟如下：1) 固定：用70%FAA固定液固定48 h；2) 脫水：將固定液倒去，依此加入70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精，時(shí)間為1 h；3) 透明：依次加入1/2二甲苯+1/2純酒精番紅飽和溶液(4 h)、二甲苯(1 h)、二甲苯(1 h)、1/3二甲苯+2/3石蠟屑(40 ℃過夜)；4) 包埋、修塊、切片、貼片；5) 脫蠟：烘干后的切片一次放入二甲苯(20 min)、二甲苯(20 min)、1/2二甲苯+1/2無水乙醇(10 min)、100%酒精(10 min)、0.5%固綠染液(20 s)、95%酒精(2 s)、100%酒精(5 min)、1/2二甲苯+1/2無水乙醇(5 min)、二甲苯(5 min)、二甲苯(2 min)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花黃精種子萌發(fā)過程表觀形態(tài)特征

2.1.1多花黃精種子萌發(fā)過程階段的劃分

通過體式顯微鏡觀察多花黃精種子萌發(fā)的形態(tài)變化，將其分為6個(gè)階段：剛采摘、未萌發(fā)、剛萌發(fā)、小球莖形成、初生根莖形成和出苗。

2.1.2多花黃精種子萌發(fā)過程外部形態(tài)特征

剛采摘的多花黃精種子外觀呈不規(guī)則卵圓形，具蠟質(zhì)，亮黃色，種皮外附有綠色物質(zhì)，無法完全洗去；種臍為種子與果實(shí)連接斷裂處，呈放射狀，黑褐色(圖1 A)；種臍對面為種孔，呈黑褐色圓點(diǎn)狀。經(jīng)過4個(gè)月的低溫沙藏，種皮外附有的綠色物質(zhì)褪去，出現(xiàn)裂紋(圖1 B)；胚伸長到種孔處，種孔有明顯凸起(圖1 C)。低溫沙藏處理結(jié)束后，將種子放在人工氣候箱黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，10 d后多花黃精種子開始萌發(fā)(圖1 D)。種子萌發(fā)后第8天時(shí)形成肉眼可見的膨大部位，稱之為“小根莖”[11]，小根莖和種子通過子葉聯(lián)結(jié)連接，另一端伸出主根，與主根垂直的地方形成芽(圖1 E)，種子萌發(fā)后第11天開始陸續(xù)伸出第1側(cè)根、第2側(cè)根等(圖1 F)。種子萌發(fā)后第35天，初生根莖基本形成(圖1 G)，種子萌發(fā)后第50天，芽開始伸長，尖端呈綠色(圖2 G)。

2.1.3多花黃精種子萌發(fā)過程形態(tài)變化

從表1可知，多花黃精種子百粒鮮重在低溫沙藏前為3.92 g，低溫沙藏1個(gè)月后，種子重量為4.20 g，增加了7%，與低溫沙藏前差異達(dá)到極顯著水平，之后種子百粒重?zé)o顯著差異。低溫沙藏結(jié)束后，種子開始大量吸水，種子萌發(fā)時(shí)，百粒重為6.44 g；小根莖形成時(shí)，百粒重為8.28 g；初生根莖基本形成時(shí)，百粒重為9.90 g；出苗時(shí)，百粒重為9.90 g。

對種子長、寬和厚的測量表明，種子低溫沙藏1個(gè)月后，種子的長有極顯著增長，由4.16 mm增至4.36 mm，之后3個(gè)月低溫沙藏中，種子大小無顯著變化，種子低溫沙藏結(jié)束后迅速吸脹，長、寬和厚均極顯著增長，其中種子長由4.39 mm增至4.71 mm，種子寬由4.54 mm增至4.73 mm，種子厚由3.70 mm增至3.92 mm，之后種子大小基本無顯著變化。

2.2 多花黃精種子萌發(fā)過程解剖結(jié)構(gòu)變化

2.2.1多花黃精種子低溫沙藏過程胚率的變化

種子解剖結(jié)果顯示，剛采摘的多花黃精種子由種皮、胚乳和胚3部分組成(圖2 A)，其中胚乳占種子體積的大部分，胚被胚乳和種皮包被，胚率約為45.12%；種子經(jīng)過低溫沙藏處理，種胚增長比較緩慢，低溫沙藏4個(gè)月種子，胚伸長到種孔處(圖2中B)，胚率為47.39%，同剛采摘的種子胚率相比顯著增加。

表1 多花黃精種子形態(tài)變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，大寫字母表示0.01水平上差異極顯著。

注：A為多花黃精種子種臍；B為低溫沙藏后種子(種皮綠色褪去，種皮龜裂)；C為低溫沙藏后種子種孔(種孔向外凸出)；D為萌發(fā)1 d時(shí)種子；E為萌發(fā)3 d時(shí)種子；F為萌發(fā)12 d時(shí)種子；G為萌發(fā)35 d時(shí)種子。Hi為種臍；Sc為種皮；Mi為種孔；Ra為胚根；Ge為胚芽；Cp為子葉聯(lián)結(jié)。

圖1 多花黃精種子萌發(fā)過程表觀觀察

2.2.2多花黃種子萌發(fā)過程胚乳變化

多花黃精種子的胚被胚乳包裹，經(jīng)過4個(gè)月的低溫沙藏，種孔附近的胚乳降解，胚伸長到靠近種孔(圖2中B)。開始萌發(fā)后，胚從種孔伸出(圖2中C)，種子萌發(fā)后第3天，胚全部伸出種子(圖2中D)，通過吸器連接種子內(nèi)外結(jié)構(gòu)。隨著萌發(fā)時(shí)間的后延，吸器不斷膨大，胚乳面積逐漸減小，且吸器和胚乳之間有過渡層(圖2中E～G)，此過程為胚乳弱化[12]，胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)被吸器吸收轉(zhuǎn)移，用于種子的萌發(fā)生長。

2.2.3多花黃精種子萌發(fā)過程中的各結(jié)構(gòu)的顯微結(jié)構(gòu)特征

多花黃精種子萌發(fā)前，胚無明顯分化，結(jié)構(gòu)簡單，沒有胚芽、胚軸、胚根和子葉的分化，呈棒狀，處于棒型胚時(shí)期(圖2中H)。子葉聯(lián)結(jié)有2束維管束，1束連接胚根，1束連接胚芽(圖2中I，J)，給胚芽和胚根的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，此現(xiàn)象與黃精相同，與滇黃精不同[8-9]。隨著種子的不斷生長，吸器逐漸變大，呈頭狀結(jié)構(gòu)(圖2中F)，吸器與子葉聯(lián)結(jié)連接部分的細(xì)胞細(xì)長(圖2中K);對吸器進(jìn)行縱切，觀察到中軸部分的細(xì)胞細(xì)長，形成維管束(圖2中L)。胚芽分化過程中子葉鞘有舌狀鞘的分化(圖2中M)，舌狀鞘發(fā)育良好，對胚芽具有更好的保護(hù)作用[13]。對主根進(jìn)行縱切，觀察到主根有1束維管束(圖2中N)。

3 結(jié)論與討論

3.1 多花黃精種子萌發(fā)過程特點(diǎn)

3.1.1多花黃精種子萌發(fā)過程表觀形態(tài)特征

通過體式顯微鏡觀察多花黃精種子萌發(fā)的形態(tài)變化，將其萌發(fā)的形態(tài)分為：剛采摘、未萌發(fā)、剛萌發(fā)、小球莖形成、初生根莖基本形成和出苗階段。

種子萌發(fā)過程包括快速吸水、緩慢吸水、吸水停滯和后萌發(fā)4個(gè)階段[14]。本研究表明，低溫沙藏處理1個(gè)月，多花黃精種子重量顯著增加，繼續(xù)低溫沙藏處理3個(gè)月，種子重量無顯著變化。結(jié)果顯示，低溫沙藏處理1個(gè)月，多花黃精種子在經(jīng)歷快速吸水、緩慢吸水后可能處于吸水停滯階段；后3個(gè)月，種子處于吸水停滯階段；低溫沙藏處理結(jié)束后，種子開始萌發(fā)，經(jīng)歷剛萌發(fā)、小球莖形成、初生根莖基本形成和出苗階段，在這5個(gè)階段中，種子重量均顯著增加，處于后萌發(fā)階段。

3.1.2多花黃精種子萌發(fā)過程解剖結(jié)構(gòu)變化

通過解剖不同萌發(fā)時(shí)期的多花黃精種子發(fā)現(xiàn)，剛萌發(fā)的多花黃精種子胚被厚厚的胚乳包裹。低溫沙藏4個(gè)月后的種子，胚與種孔間的胚乳降解，胚生長到種孔處。隨著種子的萌發(fā)，胚乳面積逐漸減小，吸器面積逐漸增大，可能是胚乳降解產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)被吸器吸收運(yùn)輸?shù)阶尤~聯(lián)結(jié)，作用在小根莖生長上。

種子發(fā)芽的可見標(biāo)志一般是包被胚的組織被胚根穿破[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，剛采摘的多花黃精種子胚分化不明顯，結(jié)構(gòu)簡單。隨著種子的不斷萌發(fā)，形成肉眼可見的膨大部位，多花黃精的胚根和胚芽在此處分化。通過對“小根莖”與種子中間部分進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)該部分有2束維管束，一束向上連接胚芽，一束向前連接胚根，所以“小根莖”與種子中間部分并不是胚根，而是子葉聯(lián)結(jié)，因此多花黃精種子的發(fā)芽標(biāo)志并不是胚根突破種皮，而是子葉聯(lián)結(jié)先突破種皮，隨后在子葉聯(lián)結(jié)上分化出胚根和胚芽，故形態(tài)成熟的多花黃精種子，其胚未分化出明顯的子葉、胚芽和胚根，隨著種子的萌發(fā)而分化成成熟胚，這種現(xiàn)象與黃精種子[13]一致。

3.2 多花黃精種子具有形態(tài)生理休眠特點(diǎn)

種子休眠是指具有生活力的種子在適宜的萌發(fā)條件下仍然不能萌發(fā)的現(xiàn)象[16]。Baskin等[17]將種子休眠分為物理休眠(physical dormancy,PY)、生理休眠(physiological dormancy,PD)、形態(tài)休眠(morphological dormancy,MD)、復(fù)合休眠(PY+PD)和形態(tài)生理休眠(morphophysiology dormancy,MPD)5個(gè)種類。本研究顯示，剛采收的多花黃精種子的種皮具蠟質(zhì)，亮黃色，種皮外附有綠色物質(zhì)，無法完全洗去，種皮的厚度和結(jié)構(gòu)可以影響種子的透氣性和透水性[18]。將采收后的多花黃精種子進(jìn)行低溫沙藏處理，1個(gè)月后種子重量顯著增加，說明種皮的具蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)并沒有對種子的吸水萌發(fā)造成影響。剛采摘的多花黃精種子的胚被厚厚的胚乳包裹，胚乳在支撐胚生長方面起著非常重要的作用，通過提供營養(yǎng)物質(zhì)，保護(hù)胚并控制胚生長，在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中作為機(jī)械屏障[19]。在低溫沙藏過程中，多花黃精種子的胚在緩慢向種孔生長，低溫沙藏4個(gè)月后，胚與種孔間的胚乳降解，胚生長到種孔處，種孔有明顯凸起。許多植物種子存在大而堅(jiān)硬的胚乳，其萌發(fā)過程中單純依靠胚根細(xì)胞的伸長生長還不足以突破堅(jiān)硬的胚乳組織，萌發(fā)的完成還需要胚乳自身進(jìn)行弱化[15]，說明多花黃精種子萌發(fā)需要胚乳自身進(jìn)行弱化，進(jìn)而說明多花黃精種子的休眠與胚乳的限制有關(guān)，故多花黃精種子存在生理休眠。有研究表明，多花黃精種子休眠屬于胚本身原因引起的休眠[20]。對剛采摘的多花黃精種子胚進(jìn)行解剖學(xué)觀察，其結(jié)構(gòu)簡單，分化不明顯，呈棒狀，處于“棒型胚”時(shí)期，這與黃精種子一致[13]，這樣的結(jié)構(gòu)說明多花黃精種子存在一個(gè)形態(tài)后熟階段，這種結(jié)構(gòu)是造成多花黃精種子萌發(fā)緩慢的原因之一，故多花黃精種子存在形態(tài)休眠。綜上所述，多花黃精種子具有形態(tài)生理休眠特性。

注：A為低溫沙藏前的種子縱切；B為低溫沙藏后種子縱切(胚接近種孔)；萌發(fā)后不同時(shí)期種子內(nèi)部胚乳觀察：C為萌發(fā)1 d時(shí)種子；D為萌發(fā)3 d時(shí)種子；E為萌發(fā)8 d時(shí)種子(箭頭所指為2種不同類型的胚乳)；F為萌發(fā)30 d時(shí)種子；G為萌發(fā)50 d時(shí)種子。H～N多花黃精種子解剖結(jié)構(gòu)：H為胚縱切；I為子葉聯(lián)結(jié)橫切(圖中可見兩束維管束)；J為子葉聯(lián)結(jié)縱切(兩束維管束，一束向上連接胚芽，一束連接胚根)；K為吸器縱切；L為吸器中軸縱切(箭頭所指為吸器中不同類型細(xì)胞)；M為胚芽縱切；N為主根縱切(一束維管束)。Vb為維管束；Ha為吸器；Cp為子葉聯(lián)結(jié)；Ls為舌狀鞘。

圖2 多花黃精種子萌發(fā)過程解剖觀察

3.3 多花黃精種子萌發(fā)成苗快慢問題

本實(shí)驗(yàn)研究了多花黃精種子萌發(fā)過程中的形態(tài)變化及解剖特征，但是萌發(fā)成苗時(shí)間長的問題仍待解決。有研究表明，種胚形態(tài)未成熟和胚乳吸水障礙，是黃精種子休眠的主要原因[8]。胚乳弱化是黃精種子能否萌發(fā)的最后開關(guān)[21]。胚乳弱化包括細(xì)胞壁的酶促和非酶促松弛機(jī)制[22]。ABA抑制種子萌發(fā)是因?yàn)锳BA抑制了胚的生長，內(nèi)向外“頂”的力量缺失,種子就無法完成萌發(fā)[23]。根據(jù)本研究的結(jié)果，對促進(jìn)多花黃精種子萌發(fā)成苗的措施提出3點(diǎn)設(shè)想：一是去除多花黃精種子種孔處胚乳能加快多花黃精種子萌發(fā)成苗；二是提高細(xì)胞壁降解酶活性能加快多花黃精種子萌發(fā)成苗；三是降低ABA含量能加快多花黃精種子萌發(fā)成苗。