一測多評法測定山豆根中3個非生物堿成分含量△

黃樂，姚彩云，梁瑩，閆炳雄，劉喜慧，吳云秋，阮麗君，繆劍華*，宋志軍*

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023

山豆根Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根莖，又名廣豆根、越南槐等，《中國植物志》記載山豆根為藤狀灌木，幾不分枝，莖上常生不定根，產(chǎn)于廣東、廣西、四川、湖南、江西等地[1]。其性味苦寒，歸肺、胃經(jīng)，有清熱解毒、消腫利咽之功效，臨床常用于咽喉腫痛、齒齦腫痛及慢性肝炎[2-3]。山豆根中主要含有苦參堿型等生物堿類化合物，以及黃酮類、三萜類和多糖類等非生物堿類化合物[4-8]。生物堿是山豆根的部分活性成分，許多藥理活性研究集中在生物堿方面。但近年來的研究表明，山豆根的非生物堿類成分同樣具有許多重要的藥理活性，如抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化等[5]。

對山豆根非生物堿類活性成分的研究發(fā)現(xiàn)，高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇顯現(xiàn)出較好的藥理活性。高麗槐素具有較好的抗炎、抗腫瘤、抗病毒活性[9-10]。Lee等[11]發(fā)現(xiàn)，高麗槐素對單胺氧化酶-B有高效性、選擇性和可逆性的抑制作用；Mizuguchi等[12]采用甲苯-2，4-二異氰酸酯(TDI)致敏的鼻超敏大鼠模型，發(fā)現(xiàn)高麗槐素可通過抑制組胺H1受體(H1R)和白細(xì)胞介素-4基因的表達(dá)緩解TDI致敏大鼠的鼻腔癥狀，其分子機(jī)制為通過抑制偶聯(lián)堿性磷酸酶(PKC delta)的激活而抑制H1R基因表達(dá)；Aratanechemuge等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60中，高麗槐素可將DNA裂解為寡核小體大小的片段，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制HL-60細(xì)胞的生長。紅車軸草苷為山豆根中含量較高的非生物堿成分，對4種癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，通過G2/M期細(xì)胞周期阻滯和抑制雷帕霉素靶蛋白/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(mTOR/PI3K/Akt)信號通路抑制胃癌SNU-5細(xì)胞生長[14]；通過激活表皮生長因子受體-絲裂原活化蛋白激酶(EGFR-MAPK)信號通路，抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的生長[15]。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紅車軸草苷能抑制脂多糖誘導(dǎo)的包括腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-6在內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，且對人卵巢癌A2780和肺癌H23細(xì)胞的生長有抑制作用。此外，紅車軸草苷還具有保肝、抗哮喘和抑制黑色素合成等活性[17-19]。越南槐醇對人早幼粒白血病細(xì)胞增殖有一定的抑制作用[20]。由此可見，這3個非生物堿成分在山豆根的清熱解毒、消腫利咽功效中有重要作用，可作為山豆根質(zhì)量評價的指標(biāo)成分。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，山豆根非生物堿部位有較好的抗癌活性[15]。非生物堿部位主要含高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇，這3個成分在山豆根中的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.8%。在75%乙醇提取物中平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為11.0%。本研究以含量較高且廉價易得的高麗槐素為參照物，計算出高麗槐素與紅車軸草苷和越南槐醇之間的相對校正因子，建立山豆根中3個非生物堿的一測多評(quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)方法。并通過QAMS法計算3個成分的含量，同時將其與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較，探討該方法用于山豆根藥材成分含量測定的可行性，為山豆根非生物堿類成分含量的研究提供參考，為該藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器(PDA)檢測器(美國Waters公司)；BSA124S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；JP-060ST型超聲波清洗儀(上海嘉鵬科技有限公司)；超純水系統(tǒng)(Milipore公司)。

1.2 試藥

山豆根采集于廣西7個不同產(chǎn)地，每個產(chǎn)地取3株，編號S1～S21，共21批，見表1。經(jīng)廣西藥用植物園韋坤華研究員鑒定為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根莖。

表1 山豆根的采集地和編號

對照品紅車軸草苷、越南槐醇、高麗槐素均為本實(shí)驗(yàn)室分離純化(1H-NMR、13C-NMR測得數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比鑒定化合物[21-23])，經(jīng)HPLC面積歸一化法測得純度≥98%；色譜純乙腈和甲醇購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脫(0～5 min，25%A；5～55 min，25%～50%A；55～80 min，50%～95%A)。體積流量為1.0 mL·min-1，檢測波長為205 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別取高麗槐素、紅車軸草苷、越南槐醇適量，精密稱取，配制成質(zhì)量濃度分別為0.175、0.140、0.070 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取各批次樣品粉末約2.0 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 75%乙醇溶液，85 ℃水浴回流提取2 h。冷卻至室溫，濾過，上D101型大孔樹脂柱，依次用蒸餾水、39%乙醇、95%乙醇洗脫，收集40%～95%乙醇提取部位，蒸干溶劑后用甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性考察 精密吸取2.2項下對照品溶液和2.3項下供試品溶液(S1)各10 μL，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果表明，供試品溶液圖譜中1～3號色譜峰的保留時間與混合對照品溶液圖譜一致，表明該方法具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性。

注：A.樣品(S1)；B.對照品；1.紅車軸草苷；2.高麗槐素；3.越南槐醇。圖1 山豆根樣品和混合對照品HPLC圖

2.4.2線性關(guān)系考察 按2.1項下色譜條件測定，取2.2項下對照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、8、10、15、20 μL，記錄色譜峰面積，以各對照品的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表2。各待測成分相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 5，表明線性關(guān)系良好。

表2 山豆根中3個非生物堿類成分線性關(guān)系考察

2.4.3精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各化合物的峰面積，計算其RSD。結(jié)果表明，高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇峰面積的RSD分別為1.02%、0.76%和1.65%，表明該方法精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品(S2)溶液，分別于制備后0、3、6、9、14、24 h進(jìn)樣分析，計算各成分峰面積RSD。結(jié)果表明，高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇峰面積的RSD分別為0.77%、0.47%和1.49%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5重復(fù)性試驗(yàn) 稱取樣品(S2)粉末6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別按照2.3項下供試品的制備方法制備供試品溶液6份，按照2.1項下色譜條件，各精密吸取10 μL測定，記錄峰面積，以建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各待測成分的含量及RSD。結(jié)果表明，高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇峰面積的RSD分別為0.33%、0.82%和1.88%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn) 稱取樣品(S2)粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別加入與待測成分含量相近的各對照品，按2.3項下供試品的制備方法制備供試品溶液，按照2.1項的色譜條件，分別精密吸取10 μL，測定并計算6個待測成分的加樣回收率及RSD。結(jié)果表明，高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇平均回收率分別為101.54%、100.06%和95.64%，RSD分別為1.07%、1.34%和1.11%，表明回收率均符合要求。

2.5 相對校正因子(fS/i)的確定

分別吸取2.2項下混合對照品溶液2、4、8、10、15、20 μL，按2.1項下色譜條件測定，以高麗槐素為內(nèi)參物(S)，測定紅車軸草苷(A)、越南槐醇(B)的峰面積，按公式(1)計算fS/i。

fS/i=fS/fi=ASCi/AiCS

(1)

其中AS為內(nèi)參物的峰面積，CS為內(nèi)參物的濃度，Ai為待測組分的峰面積，Ci為待測組分的濃度。

結(jié)果表明，紅車軸草苷的fS/A平均值為1.609，越南槐醇的fS/B平均值為0.774。結(jié)果見表3。

表3 山豆根中3個非生物堿成分的fS/i

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，最終確定了紅車軸草苷的相對校正因子fS/A為1.609；越南槐醇的相對校正因子fS/B為0.774。

2.6 fS/i耐用性評價

2.6.1不同液相色譜儀器及色譜柱對fS/i的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了Waters e2695、VARIAN LC210 2種液相色譜系統(tǒng)以及Agilent Plus C18、Agilent HPH C18、Agilent TC C183種色譜柱對fS/i的影響，結(jié)果見表4，表明不同液相色譜儀器及色譜柱對各待測成分的fS/i無顯著影響。

表4 不同液相色譜儀器及色譜柱對fS/i的影響

2.6.2不同柱溫對fS/i的影響 采用Waters e2695液相色譜系統(tǒng)和Agilent Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，考察不同柱溫25、30、35 ℃對fS/i的影響，結(jié)果見表5。表明柱溫對各待測成分的fS/i無顯著影響。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.7 QAMS與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

分別取21批山豆根各2.0 g，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和QAMS計算山豆根樣品中3個成分的含量。結(jié)果見表6。

表6 QAMS法與外標(biāo)法測得21批山豆根中3個成分的含量(n=3) %

2.8 QAMS法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果的t檢驗(yàn)

采用SPSS 25軟件，對外標(biāo)法與QAMS測得的21批山豆根中紅車軸草苷和越南槐醇含量結(jié)果進(jìn)行成對樣品t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，2種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.9 QAMS法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果的聚類分析

分別以外標(biāo)法及QAMS測定的21批山豆根中高麗槐素、紅車軸草苷、越南槐醇的含量為變量，導(dǎo)入SPSS 25軟件，選用平均組間連接聚類方法，以平均歐式距離法作為樣品間距離計算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果見圖2。聚類分析結(jié)果表明，分別以QAMS和外標(biāo)法測定的含量聚類分析結(jié)果一致，當(dāng)分類距離為20時，21批山豆根可以分為兩類。S5、S9、S16樣品聚為一類，其余樣品聚為一類。

注：A.外標(biāo)法；B.QAMS。圖2 QAMS法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果的聚類分析

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

分別取高麗槐素、紅車軸草苷、越南槐醇對照品溶液，采用PAD在190～600 nm波長進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，高麗槐素在205、280 nm波長處有最大吸收，紅車軸草苷在280、310 nm波長處有最大吸收，越南槐醇在290、360 nm波長處有最大吸收。對205、280、310、360 nm波長下山豆根供試品溶液HPLC色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果在205 nm波長檢測下供試品信息量大、各色譜峰分離度較好、基線平穩(wěn)，故選擇205 nm為測定波長。

3.2 提取溶劑的選擇

分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇(75%、80%、85%)對山豆根非生物堿提取率的影響，結(jié)果表明，75%、80%和85%乙醇作為溶劑，山豆根的非生物堿提取率分別為4.50%、4.19%和4.36%。故選用75%乙醇作為提取溶劑。

本研究以高麗槐素為內(nèi)參物，建立了紅車軸草苷的fS/A為1.606、越南槐醇的fS/B為0.774的QAMS定量方法。該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及耐用性較好，均符合分析要求。采用該方法，檢測了21批山豆根中的高麗槐素、紅車軸草苷和越南槐醇的含量，t檢驗(yàn)與聚類分析結(jié)果顯示，該方法與外標(biāo)法測定結(jié)果基本一致，可以用于這3個非生物堿的含量測定。本研究結(jié)果可為山豆根的質(zhì)量控制與質(zhì)量評價提供新思路和參考。