髓系KLF5基因缺失小鼠腹主動脈瘤形成的生物信息學(xué)分析

常全，張娜娜，馬冬

腹主動脈瘤（AAA）是一種老年常見高死亡率的心血管系統(tǒng)疾病，目前臨床上仍無有效治療藥物，發(fā)病機制仍不明確[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KLF5基因在人和小鼠AAA組織中表達(dá)升高，并且小鼠髓系特異性敲除KLF5基因能夠下調(diào)Myo9b表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞的浸潤并抑制小鼠AAA的形成，但是對于詳細(xì)的KLF5基因調(diào)控炎癥相關(guān)基因表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)分析仍需探討[2]。因此，為了進一步驗證髓系KLF5基因表達(dá)在炎癥和AAA形成過程中的促炎作用，本實驗系統(tǒng)分析了CaPO4誘導(dǎo)髓系KLF5基因表達(dá)缺失（LyKLF5-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠AAA組織的mRNA表達(dá)譜，利用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站對血管炎癥及AAA形成相關(guān)的基因進行功能和網(wǎng)絡(luò)分析，為尋找有效藥物治療AAA疾病提供新的分子靶點和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性的C57BL/6小鼠，SPF級，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將其中KLF5-flox小鼠和LysM-cre小鼠雜交培育雄性髓系遺傳性LyKLF5-/-小鼠3只，并與同籠WT C57BL/6小鼠3只，AAA模型構(gòu)建后共同培養(yǎng)14 d。LyKLF5-/-小鼠和WT 6～8周齡雄性小鼠（Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）均由本實驗室繁殖提供。

1.2 研究時間 2015年1月—2016年1月進行小鼠培養(yǎng)及mRNA芯片篩查。2019年2—4月對差異基因進行生物信息學(xué)分析。

1.3 CaPO4誘導(dǎo)小鼠AAA模型[3]將LyKLF5-/-小鼠和WT小鼠進行持續(xù)麻醉，無菌條件下進行腹部手術(shù)，暴露腹主動脈血管，分離腎動脈分支至髂總動脈血管，先包裹浸有CaCl2的無紡布條，后換為浸有磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的無紡布條。取出棉條后用0.9%氯化鈉溶液沖洗，縫合內(nèi)膜，撒上青霉素粉末，再縫合腹部外膜。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：造模后腹主動脈最大直徑（d2）/瘤旁血管直徑（d1）≥2。所有小鼠造模成功，實驗過程沒有死亡。

本研究創(chuàng)新點：

（1）應(yīng)用生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)髓系KLF5基因表達(dá)缺失小鼠抑制腹主動脈瘤（AAA）形成的炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。（2）發(fā)現(xiàn)主要基因Bcas3、Hck表達(dá)上調(diào)和Retnla、Olig1、Tnfrsf11a表達(dá)下調(diào)參與炎癥調(diào)控，為靶向治療AAA提供新的分子靶點。

本研究不足：

本研究未進行臨床研究，可能存在基因表達(dá)之間的相互影響，導(dǎo)致研究結(jié)果并不準(zhǔn)確。

1.4 腹主動脈組織總RNA的提取及mRNA表達(dá)譜的檢測 分離小鼠損傷腹主動脈，剪碎血管，置于RNA-Solv的勻漿套管中勻漿（冰盒中操作）。室溫靜置2～3 min。在勻漿液中加入200 μl的三氯甲烷，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為8 cm），勻漿液分為3層。吸取上層水相，先后加入無水乙醇、300 μl的RNA洗脫緩沖液Ⅰ、400 μl RNA洗脫緩沖液Ⅰ，10 000 r/min離心30～60 s（離心半徑為8 cm），棄去流出液。然后加入500 μl無水乙醇稀釋的RNA洗脫緩沖液Ⅱ 2次，分別進行10 000 r/min離心30～60 s（離心半徑為8 cm），棄去流出液，洗滌2次。最后加入20 μl焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，并于-80 ℃保存。確定RNA完整無降解后，用核酸定量儀進行定量，得到RNA濃度，OD260/280在1.8～2.0范圍內(nèi)?；蛐酒瑱z測由康成生物有限公司完成。

1.5 差異表達(dá)基因的富集分析 將芯片篩查的Fold Change Absolute（|FC|）≥2的全部上調(diào)差異基因或下調(diào)差異基因輸入Metascape在線分析網(wǎng)站，對差異表達(dá)基因進行GO功能富集分析和KEGG富集分析，以探究LyKLF5-/-是通過影響哪些功能和分子途徑抑制AAA形成的。GO功能富集分析時差異基因的P值設(shè)為0.01，KEGG富集分析時P值設(shè)為0.03。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 分析差異基因編碼的蛋白與其他蛋白的相互作用，利用STRING在線數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，分別得到Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a相關(guān)基因及其對AAA形成的影響。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點表示蛋白，線段表示交互作用。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因mRNA表達(dá)差異分析 mRNA芯片共篩選到上調(diào)表達(dá)基因646個，下調(diào)表達(dá)基因1 410個（|FC|≥2，P＜0.05）。mRNA表達(dá)譜前50個基因表達(dá)差異熱圖分析結(jié)果如圖1（彩圖見本刊官網(wǎng)電子版）所示，排名前10的上調(diào)和下調(diào)差異基因的表達(dá)倍數(shù)見表1～2。組織芯片結(jié)果顯示：與WT小鼠比較，抑制炎癥的基因在LyKLF5-/-小鼠表達(dá)增加，Bcas3、Hck基因表達(dá)分別上調(diào)3.96、3.14倍；促進炎癥的基因在LyKLF5-/-組表達(dá)降低，Retnla、Olig1、Tnfrsf11a分別下調(diào)7.68、5.07、3.66倍。

2.2 GO功能富集分析和KEGG 富集分析 將篩選出的上調(diào)差異基因和下調(diào)差異基因進行GO功能富集分析和KEGG 富集分析，上調(diào)差異基因GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程中多肽抗原合成和表達(dá)的調(diào) 控（regulation of antigen processing and presentation of peptide antigen）、核苷二磷酸代謝過程（nucleoside diphosphate metabolic process）、肌節(jié)組織的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of sarcomere organization）顯著富集（見圖2A）；分子功能變化最為明顯的是單糖結(jié)合（monosaccharide binding）、MAP激酶結(jié)合（mitogenactivated protein kinase binding）和轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity）以及轉(zhuǎn)移含氮基團（transferring nitrogenousgroups）（見圖2B）；而在細(xì)胞成分中溶酶體（lysosome）、核膜（nuclear envelope）和傳遞質(zhì)子的v型ATP酶以及V0結(jié)構(gòu)域（V0 domain）富集最為顯著（見圖2C）。其中增加多肽抗原合成和表達(dá)、核苷二磷酸的代謝[4]、MAPK結(jié)合[5]可能直接或間接控制炎癥的產(chǎn)生；而某些單糖的合成可能抑制炎癥[6]，包括自噬溶酶體途徑或許是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一[7-9]。

表1 CaPO4誘導(dǎo)LyKLF5-/-和WT小鼠AAA組織mRNA表達(dá)譜上調(diào)的前10個基因Table 1 Top 10 up-regulated mRNA expression profiles in CaPO4-injured AAA tissues from LyKLF5-/- and WT mice

圖1 CaPO4誘導(dǎo)LyKLF5-/-和 WT小鼠AAA組織基因芯片圖Figure 1 Gene chip of CaPO4-injured AAA tissues from LyKLF5-/- and WT mice

下調(diào)差異基因GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程中生長發(fā)育（developmental growth）、細(xì)胞對葡萄糖刺激反應(yīng)的胰島素分泌調(diào)節(jié)（regulation ofinsulin secretion involved in cellular response to glucose stimulus）、平滑肌細(xì)胞遷移的正調(diào)控（positive regulation of smooth muscle cell migration）顯著富集（見圖3A）；分子功能變化最為明顯的是肌動蛋白結(jié)合（actin binding）、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（extracellular matrix structural constituent）和跨膜受體蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）（ 見圖3B）；而在細(xì)胞成分中轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（transferase complex）、肌動蛋白細(xì)胞骨架（actin cytoskeleton）和受體復(fù)合物（receptor complex）富集最為顯著（見圖3C）。其中平滑肌細(xì)胞遷移促進炎癥[10]，并且急性炎癥及慢性炎癥的產(chǎn)生均存在肌動蛋白的調(diào)控[11-12]。

表2 CaPO4誘導(dǎo)LyKLF5-/-和WT小鼠AAA組織mRNA表達(dá)譜下調(diào)的前10個基因Table 2 Top 10 down-regulated mRNA expression profiles in CaPO4-injured AAA tissues from LyKLF5-/- and WT mice

KEGG富集分析結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞分化（osteoclast differentiation）、吞噬小體（phagosome）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）在上調(diào)差異基因通路中顯著富集；血管平滑肌收縮（vascular smooth muscle contraction），泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用（ubiquitin mediated proteolysis）以及肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控（regulation of actin cytoskeleton）在下調(diào)差異基因通路中最為顯著（見圖4）。其中與炎癥相關(guān)的通路包括破骨細(xì)胞分化[13-14]、血管平滑肌收縮[15]、肌動蛋白骨架[12]等。

圖2 上調(diào)差異表達(dá)基因GO功能富集分析Figure 2 GO analysis for up-regulated gene differential expression

圖3 下調(diào)差異表達(dá)基因GO功能富集分析Figure 3 GO analysis for down-regulated gene differential expression

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 蛋白互作分析可為分子機制研究提供重要線索。將選取的炎癥相關(guān)基因輸入到STRING在線數(shù)據(jù)庫，選取交互作用評分＞0.7的互作關(guān)系，構(gòu)建髓系KLF5基因缺失影響炎癥相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建結(jié)果顯示，有5個靶基因蛋白（上調(diào)差異基因Bcas3、Hck和下調(diào)差異基因Retnla、Olig1、Tnfrsf11a）均與STRING數(shù)據(jù)庫中蛋白匹配，其與其相互作用蛋白的關(guān)系如圖5所示。

3 討論

AAA發(fā)病機制復(fù)雜，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥、先天免疫、微小RNA（miRNA）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基質(zhì)金屬蛋白酶等多種機制均參與AAA的發(fā)生和發(fā)展[1]，但AAA形成和發(fā)展的具體機制仍難以確定。AAA的發(fā)病起源于動脈管壁上的炎癥，炎性細(xì)胞通過刺激蛋白酶介導(dǎo)ECM和VSMC的降解，導(dǎo)致主動脈管壁的破壞，所以，分析炎癥調(diào)控AAA的機制尤為重要。目前尚缺少AAA形成過程中的血管炎性因素的生物信息學(xué)分析證明。本研究運用基因芯片技術(shù)篩選LyKLF5-/-和WT小鼠差異基因，并運用生物信息學(xué)方法直觀地了解差異基因的富集通路及主要功能，以探討KLF5在AAA中的調(diào)控機制。

圖4 差異基因的KEGG 富集分析Figure 4 KEGG analysis for gene differential expression

圖5 差異表達(dá)基因蛋白與其互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Gene differential expression proteins and their interaction network

本研究發(fā)現(xiàn)，GO功能富集分析和KEGG富集分析中上調(diào)差異基因富集于有關(guān)抑制炎癥的通路；下調(diào)差異基因富集于有關(guān)促進炎癥的通路。并且通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析證實，篩選出的Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a及其相關(guān)蛋白參與炎性反應(yīng)。其中上調(diào)差異基因Bcas3通過促進雌激素分泌的作用抑制炎性反應(yīng)[16-17]；Hck主要抑制局部炎性淋巴細(xì)胞反應(yīng)[18]，且在前列腺良性病變中高表達(dá)而在前列腺癌中低表達(dá)；下調(diào)差異基因Retnla促進巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的代謝疾病炎癥[19-21]，其相關(guān)蛋白促進免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)；Olig1使新生大鼠生后早期感染引起的腦損傷加重[22]，其相關(guān)蛋白與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)成分相關(guān)；已有研究證明KLF5通過上調(diào)Tnfrsf11a的表達(dá)促進宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移，且Tnfrsf11a相關(guān)基因參與免疫反應(yīng)[23]。趙海光等[24]篩選出人AAA與正常腹主動脈的基因表達(dá)譜進行差異表達(dá)基因的功能分析，發(fā)現(xiàn)差異基因中有與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)密切相關(guān)的基因，表明AAA的形成可能與炎癥相關(guān)。且有報道稱一系列不同的炎性細(xì)胞（主要包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞）在AAA的瘤壁中表達(dá)。本研究結(jié)果與以上觀點相符，且結(jié)果表明篩選出的Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a參與炎性反應(yīng)對AAA的調(diào)控。

本研究尚存在一定的局限性，例如本研究利用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)探討AAA的發(fā)生機制，未進行臨床研究，可能存在基因表達(dá)之間的相互影響，從而可能導(dǎo)致研究結(jié)果并不準(zhǔn)確。未來希望針對基因進行進一步研究。

綜上所述，髓系LyKLF5-/-小鼠通過對炎癥的調(diào)控來抑制AAA的產(chǎn)生，篩選出的Bcas3、Hck上調(diào)差異基因和Retnla、Olig1、Tnfrsf11a下調(diào)差異基因參與炎癥的抑制作用。這為AAA的發(fā)病機制及靶向藥物的研究提供了新思路。

作者貢獻：常全、張娜娜、馬冬進行文章的構(gòu)思與設(shè)計、數(shù)據(jù)整理、結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；常全、馬冬進行研究的實施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計學(xué)處理；馬冬進行論文修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。