大豆益生元發(fā)酵豆乳的制備及其對(duì)益生菌數(shù)量的影響

雷海容，張楓燃，梁洪祥，李曉東

（1.長(zhǎng)春大學(xué)科技開(kāi)發(fā)研究中心，吉林長(zhǎng)春130022；2.延邊大學(xué)，吉林延吉133002）

益生元是指不被人體消化吸收卻可以選擇性促進(jìn)腸道中益生菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而改善人體健康的物質(zhì)[1]。大豆低聚糖（soybean oligosaccharides，SBOS）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]中包括蔗糖，但蔗糖并無(wú)低聚糖所具有的功效。功能性SBOS 是3 糖構(gòu)成的棉子糖與4 糖構(gòu)成的水蘇糖聚合同系物，不被胃酸分解，也不被人體吸收代謝，屬于益生元范疇[3]。功能性SBOS 具有阻止致病菌的定居和繁殖，調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡；防治腹瀉與便秘的雙向調(diào)節(jié)功能[4]；降低血壓、防治肝病[5]、增強(qiáng)免疫功能[6]；預(yù)防腫瘤并使部分胃癌細(xì)胞凋亡[7]等多種保健作用。

益生菌是指對(duì)人體健康有益且與人共生的細(xì)菌或微生物。干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌同為益生菌，同屬于乳桿菌屬。兩菌株的益生保健功能除均可增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)[8-9]外，干酪乳桿菌具有降血壓、降膽固醇[10]的功效；鼠李糖乳桿菌具有改善宿主腸道健康等功效[11]。

豆乳經(jīng)益生菌的發(fā)酵作用不僅變得美味，還可分解大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，營(yíng)養(yǎng)成分更趨完善[12]，更易于人體的消化吸收。本研究是以超微粉碎后的脫皮大豆與脫脂牛乳為主要原料，利用功能性SBOS 發(fā)酵穩(wěn)定性的生物學(xué)特性，采用干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌混種發(fā)酵提純功能性SBOS，制作具有促進(jìn)增殖腸道益生菌、提高腸道功能、維持腸道健康的保健型發(fā)酵豆乳。大豆益生元發(fā)酵豆乳除上述保健功效外，還含有脫皮后大豆子葉全部的大豆蛋白質(zhì)及大豆膳食纖維，制作過(guò)程中不除渣、不產(chǎn)生廢水，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SBOS（水蘇糖與棉子糖占30%、蔗糖占40%）：長(zhǎng)春大學(xué)科技開(kāi)發(fā)研究中心；果膠：上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；蔗糖：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌：由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏并提供，兩種菌以1 ∶1 的比例添加；蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品、水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品、棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈（色譜純）：美國(guó)Sigma 公司；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（lactic acidbacteria culture，MRS）固體及液體培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；脫皮大豆、脫脂牛乳粉：市售；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

FW100 高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市象珠松青五金廠；QYF-100 實(shí)驗(yàn)室用氣流粉碎機(jī)：昆山密友實(shí)業(yè)有限公司；APV-1000 型實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)：上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LC-20A 型高效液相色譜儀、RID-10A 型示差折光檢測(cè)器：日本島津公司；CSB-SY型超聲波振蕩器：金壇市華城潤(rùn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠；ME204E 型藥物分析天平：METTLER TOLEDO 儀器公司；FA2204B 型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Mini-15K 微型高速離心機(jī)：杭州奧盛儀器有限公司；HZQ-F160（A）C 型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱：常州諾基儀器有限公司；SPX 型智能生化培養(yǎng)箱：寧波市江南儀器廠；SJ-CJ-1FDQ 型超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；DSX-18L 手提式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；AG25 厭氧培養(yǎng)罐（2.5 L）：臨沂正衡化玻儀器有限公司；WP-UP-1820 型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)：四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配制脫脂乳培養(yǎng)基

將12 g 脫脂牛乳粉加100 mL 純水制成質(zhì)量濃度12 g/100 mL 的脫脂乳液，盛入三角瓶中，封口后置于滅菌鍋中在115 ℃條件下蒸汽滅菌15 min，迅速冷卻后冷藏備用。

1.3.2 菌株的活化

將干酪乳桿菌及鼠李糖乳桿菌斜面試管從冰箱中取出，置于20 ℃下約15 min，開(kāi)啟超凈工作臺(tái)待用，在無(wú)菌條件下挑取菌種于脫脂乳培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，活化培養(yǎng)3 代，獲得活力較好的菌種。

1.3.3 發(fā)酵劑的制備

將冰箱中保存的干酪乳桿菌及鼠李糖乳桿菌斜面試管取出，置于20 ℃下約15 min，在無(wú)菌條件下挑取少許菌株接種于MRS 固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐中37 ℃厭氧培養(yǎng)至菌落清晰可見(jiàn)，進(jìn)一步挑取單菌落于MRS 液體培養(yǎng)基中，菌液保存待用。

1.3.4 檢測(cè)大豆益生元發(fā)酵豆乳發(fā)酵期間蔗糖質(zhì)量

分別稱取5.0 mL 及2.0 mL 樣品于100 mL 容量瓶中，編號(hào)后分別加乙酸鋅溶液與亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，加水定容至刻度，經(jīng)超聲波振蕩器振蕩30 min后離心，再經(jīng)0.45 μm 孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。采用高效液相色譜系統(tǒng)分離后，經(jīng)示差折光檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)樣液濃度。在一定條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算得出大豆益生元發(fā)酵豆乳發(fā)酵期間的蔗糖質(zhì)量[13]。

1.3.5 檢測(cè)大豆益生元發(fā)酵豆乳發(fā)酵期間水蘇糖與棉子糖質(zhì)量

稱取 2.0 mL 樣品，定容至 100 mL，混勻，經(jīng) 0.45 μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。采用高效液相色譜系統(tǒng)分離后，經(jīng)示差折光檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)樣液濃度。在一定條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算得出大豆益生元發(fā)酵豆乳發(fā)酵期間的水蘇糖與棉子糖質(zhì)量[14]。

1.3.6 益生菌數(shù)量的檢測(cè)

選擇正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、不同體積的大豆益生元發(fā)酵豆乳，共5 組發(fā)酵豆乳檢測(cè)其益生菌的數(shù)量。按制備方法制備發(fā)酵豆乳，采用蔗糖接種發(fā)酵豆乳作為正常對(duì)照組；采用山東產(chǎn)大豆低聚糖沖劑接種發(fā)酵豆乳作為陽(yáng)性對(duì)照組，將正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組與大豆益生元發(fā)酵豆乳加入MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，將樣液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e選擇10-8～10-13的梯度稀釋樣液各0.1 mL 涂布于平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h[15]，檢測(cè)各組分發(fā)酵豆乳中益生菌數(shù)量。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，以CFU/mL 報(bào)告測(cè)定值。

1.3.7 大豆益生元發(fā)酵豆乳的制備方法

1.3.7.1 工藝流程

1.3.7.2 操作要點(diǎn)

1）粉碎

脫皮大豆經(jīng)多功能粉碎機(jī)粗磨后98 %過(guò)80 目篩，送入頻率150 Hz 氣流粉碎機(jī)內(nèi)處理，得到直徑約為50 μm[16]的超細(xì)粉末過(guò)200 目篩。超微粉碎可使大豆膳食纖維結(jié)合水力提高1 倍[17]，品質(zhì)得以改善。

2）高溫煮沸

將過(guò)篩后的大豆全子葉豆粉按適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量體積比加純水高溫煮沸10 min[18]，期間不斷攪拌，使其分散均勻。高溫煮沸可使膳食纖維顆粒細(xì)化，提高水溶性膳食纖維轉(zhuǎn)化率，降低口感粗糙程度，使苦味與豆腥味消失，增加大豆香味，更重要的是可使大豆中對(duì)人體有害的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子鈍化失活，以實(shí)現(xiàn)預(yù)熟化目的。

3）調(diào)和、均質(zhì)與殺菌

果膠需要全部溶解后，再與脫脂乳粉及冷卻后的豆乳調(diào)和后送入均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 次，經(jīng)90 ℃條件下殺菌10 min[19]制成發(fā)酵豆乳培養(yǎng)基。均質(zhì)條件為溫度45 ℃、壓強(qiáng)30 MPa、時(shí)間120 s[20]。均質(zhì)可使豆乳中脂肪與蛋白質(zhì)粒徑減小，防止脂肪上浮，達(dá)到蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合，同時(shí)也將少量變性蛋白質(zhì)顆粒進(jìn)一步細(xì)化，并且延緩或防止凝乳形成后乳清大量析出，提高穩(wěn)定性，獲得良好的質(zhì)感，可使發(fā)酵后的豆乳組織細(xì)膩、口感柔和，更易于人體的消化吸收。

4）接種與發(fā)酵

將干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌按1 ∶1 比例接種于冷卻后的發(fā)酵豆乳培養(yǎng)基，同時(shí)加入殺菌后的SBOS 進(jìn)行發(fā)酵。益生元發(fā)酵豆乳采用干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌可利用蔗糖發(fā)酵[21]的生物學(xué)特性，以達(dá)到提純功能性SBOS 的目的。由于大豆水蘇糖與棉子糖在高溫、高壓條件下不發(fā)生分解現(xiàn)象，因此SBOS 的殺菌條件設(shè)定為121℃，壓強(qiáng)30 MPa 處理15 min。發(fā)酵期間隨時(shí)檢測(cè)蔗糖、水蘇糖及棉子糖的質(zhì)量。發(fā)酵豆乳中各組分糖質(zhì)量與發(fā)酵初始時(shí)相比：水蘇糖與棉子糖保留率達(dá)到86%以上，蔗糖消耗率達(dá)到90%以上時(shí)，即標(biāo)志發(fā)酵完成。

5）成品

將發(fā)酵完成的大豆益生元發(fā)酵豆乳放入4 ℃冰箱后熟18 h～24 h，制成成品大豆益生元發(fā)酵豆乳。采用MRS 瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)法[15]檢測(cè)益生菌數(shù)量。

1.3.8 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由孟岳成[22]研究結(jié)果可知，果膠的添加量0.3 %時(shí)，發(fā)酵豆乳表面更光滑細(xì)膩，冷藏期間更穩(wěn)定，因此果膠的添加量確定為0.3%。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的主要因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)益生元發(fā)酵豆乳的制備方法，采用單因素試驗(yàn)方案，分別研究豆粉與水的質(zhì)量體積比、脫脂乳粉添加量、SBOS 添加量、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳的感官品質(zhì)的影響，找出每個(gè)因素的具體影響規(guī)律，并確定影響大豆益生元發(fā)酵豆乳品質(zhì)的主要因素的最優(yōu)水平變化范圍。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以大豆益生元發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)為考察指標(biāo)，按表1 進(jìn)行六因素五水平的正交試驗(yàn)，篩選大豆益生元發(fā)酵豆乳的最佳工藝條件，并進(jìn)行最佳工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.9 大豆益生元發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)

以大豆益生元發(fā)酵豆乳的表觀、氣味、風(fēng)味及質(zhì)地[23]為評(píng)定指標(biāo)。通過(guò)經(jīng)培訓(xùn)過(guò)的10 位評(píng)價(jià)員，獨(dú)立進(jìn)行專(zhuān)家問(wèn)卷打分，評(píng)定每個(gè)樣品間用清水漱口，每人的各項(xiàng)指標(biāo)得分相加為總分，滿分為100 分，取每位評(píng)價(jià)員總分的平均分為感官評(píng)分值，最后統(tǒng)計(jì)得出綜合評(píng)分。大豆益生元發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 大豆益生元發(fā)酵豆乳的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of soybean prebiotic fermented soymilk

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理方法應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)定指標(biāo)均表示為3 次平行試驗(yàn)的平均值，差異顯著性采用Student-t 檢驗(yàn)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 豆粉與水的質(zhì)量體積比對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響

豆粉與水的質(zhì)量體積比對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 豆粉與水的質(zhì)量體積比對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of ratio of mass to volume of soybean and water on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

大豆通過(guò)氣流粉碎機(jī)處理后，細(xì)胞的比表面積和孔隙率均增大[16]，益生元發(fā)酵豆乳的口感與功能性均可得到改善。由圖1 可知，隨著質(zhì)量體積比的增加益生元發(fā)酵豆乳感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量體積比達(dá)到1 ∶12（g/mL）時(shí)，益生元發(fā)酵豆乳口感細(xì)膩，無(wú)粗糙的顆粒感，顏色呈乳白色，感官評(píng)分達(dá)到最高值。當(dāng)質(zhì)量體積比超過(guò)1 ∶12（g/mL）時(shí)，益生元發(fā)酵豆乳感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)，乳清析出影響了感官品質(zhì)。因此，選擇豆粉與水的最佳質(zhì)量體積比為1 ∶12（g/mL）。

2.1.2 脫脂乳粉添加量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響

脫脂乳粉添加量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 脫脂乳粉添加量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of skim milk powder addition on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

豆乳中添加牛乳可以促進(jìn)豆乳發(fā)酵，同時(shí)去除讓人不愉快的異味，改善益生元發(fā)酵豆乳風(fēng)味，提高感官品質(zhì)。由圖2 可知，隨著牛乳添加量的增加，益生元發(fā)酵豆乳的感官評(píng)分逐漸升高，當(dāng)脫脂乳粉添加24%時(shí)，益生元發(fā)酵豆乳風(fēng)味獨(dú)特，感官評(píng)分最高；當(dāng)脫脂乳粉添加量繼續(xù)增加，感官評(píng)分逐漸下降，這是由于奶油味影響益生元發(fā)酵豆乳的感官品質(zhì)。因此，選擇脫脂乳粉最佳添加量為24%。

2.1.3 SBOS 添加量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響

SBOS 添加量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，隨著SBOS 增加量的增加，益生元發(fā)酵豆乳感官評(píng)分先上升后下降，當(dāng)SBOS 添加量為25%時(shí)益生元發(fā)酵豆乳的風(fēng)味酸甜適中、凝乳堅(jiān)實(shí)、表面及切面光滑細(xì)膩，感官品質(zhì)最佳。當(dāng)SBOS 添加量超過(guò)25%，益生元發(fā)酵豆乳酸化嚴(yán)重，影響其感官品質(zhì)。因此，選擇SBOS 最佳添加量為25%。

圖3 SBOS 添加量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of SBOS addition on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of fermented time on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

由圖4 可知，當(dāng)發(fā)酵7.0 h 時(shí)益生元發(fā)酵豆乳的風(fēng)味酸甜適中、凝乳堅(jiān)實(shí)、表面及切面光滑細(xì)膩，感官品質(zhì)最佳。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)7.0 h，益生元發(fā)酵豆乳酸化嚴(yán)重，影響其感官品質(zhì)。

發(fā)酵期間各組分糖的變化見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，發(fā)酵5.5 h 蔗糖的保留率為72.55%，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)蔗糖保留率也在降低，當(dāng)發(fā)酵7.0 h時(shí)蔗糖保留率低至9.42%，棉子糖與水蘇糖的保留率分別為64.11%和94.01%，益生元的保留率為86.53%，蔗糖的消耗率為90.58%，此時(shí)結(jié)束發(fā)酵。由于發(fā)酵7.0 h 后蔗糖消耗速度逐漸緩慢，功能性SBOS 參與發(fā)酵，保留率也逐漸降低，無(wú)法達(dá)到提純功能性SBOS 的目的。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間確定為7.0 h。

2.1.5 接種量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響

接種量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖6。

圖5 發(fā)酵期間各組分糖的變化Fig.5 The curves of the change of sugars of each component during the fermentation

圖6 接種量對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響Fig.6 Effects of inoculum concentration on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

接種量的大小是影響益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的關(guān)鍵因素。接種量過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，益生元發(fā)酵豆乳產(chǎn)酸速度慢易受細(xì)菌污染；接種量過(guò)高發(fā)酵速度加快，益生元發(fā)酵豆乳過(guò)酸影響感官品質(zhì)。由圖6可知，接種量為1%～5%時(shí)，感官評(píng)分呈上升趨勢(shì)，當(dāng)接種量為5%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，接種量為5%～11%時(shí)，感官評(píng)分逐漸下降。因此，選擇最佳接種量為5%。

2.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖7。

發(fā)酵溫度是影響益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的重要因素之一。溫度過(guò)低，干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的增長(zhǎng)速度變得緩慢，益生元發(fā)酵豆乳風(fēng)味差，質(zhì)地松軟；溫度過(guò)高，干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的生理活性受到抑制，益生元發(fā)酵豆乳有豆腥味，發(fā)酵豆香味不足。由圖7 可知，發(fā)酵溫度為31 ℃～37 ℃時(shí)，感官評(píng)分逐漸上升，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，發(fā)酵溫度為37 ℃～41 ℃時(shí)，感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的影響Fig.7 Effects of fermented time on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 L25（56）正交試驗(yàn)結(jié)果、極差及方差分析

正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 3 The orthogonal experiment results and range analysis

續(xù)表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Continue table 3 The orthogonal experiment results and range analysis

由表3 可知，影響大豆益生元發(fā)酵豆乳感官品質(zhì)的因素主次順序?yàn)?RD＞RC＞RF＞RE＞RA＞RB，再以 K 值進(jìn)行分析 A4＞A3＞A5＞A2＞A1、B3＞B4＞B2＞B5＞B1、C3＞C4＞C5＞C2＞C1、D3＞D4＞D5＞D2＞D1、E4＞E5＞E3＞E2＞E1、F3＞F2＞F4＞F5＞F1，因此，制備大豆益生元發(fā)酵豆乳的最佳配方是A4B3C3D3E4F3，即豆粉與水的質(zhì)量體積比為 1 ∶12（g/mL）、脫脂乳粉添加量為24 %、SBOS 添加量為25 %、接種量為5 %、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時(shí)間為7 h、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌比例1 ∶1、果膠的添加量為0.3%、后熟時(shí)間18 h。

方差分析見(jiàn)表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 大豆益生元發(fā)酵豆乳驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述最佳工藝條件，即干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌比例1 ∶1、果膠的添加量0.3%、豆粉與水質(zhì)量體積比 1 ∶12（g/mL）、脫脂乳粉添加量 24%、SBOS 添加量25%、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 h、后熟18 h 進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。結(jié)果顯示：3 次試驗(yàn)結(jié)果的誤差較小、穩(wěn)定性較好，說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果正確可行。大豆益生元發(fā)酵豆乳感官評(píng)分與益生菌數(shù)量如表5 所示。

2.3 發(fā)酵豆乳中益生菌數(shù)量檢測(cè)結(jié)果

按制備方法制備發(fā)酵豆乳，正常對(duì)照組蔗糖的接種量為10%；陽(yáng)性對(duì)照組SBOS 接種量為3 包大豆低聚糖沖劑。正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組與大豆益生元發(fā)酵豆乳在形成凝乳后，分別于 0、6、12、18、24 h 采用MRS 瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)法[15]檢測(cè)各組分發(fā)酵豆乳中益生菌數(shù)量。結(jié)果如表6 所示。

表5 大豆益生元發(fā)酵豆乳驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of proving experiment of the soybean prebiotic fermented soymilk

表6 發(fā)酵豆乳在發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)段的益生菌數(shù)量Table 6 The probiotics amount at different time in fermentation process of fermented soymilks

由表5 可知，隨著時(shí)間的增加，各組分的發(fā)酵豆乳中干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的數(shù)量均有升高，正常對(duì)照組益生菌數(shù)量升高的幅度最小，含功能性SBOS組益生菌數(shù)量升高幅度較大，在凝乳后0～12 h 時(shí)，益生菌數(shù)量升高速度慢；在12 h～18 h 時(shí)，益生菌數(shù)量迅速升高。在凝乳24 h 時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組益生菌數(shù)量達(dá)到1.93×1012CFU/mL，是正常對(duì)照組的 1708 倍；益生元發(fā)酵豆乳100 mL 組益生菌數(shù)量達(dá)到3.03×1013CFU/mL，是正常對(duì)照組的26 814 倍；益生元發(fā)酵豆乳200 mL組益生菌數(shù)量達(dá)到4.73×1013CFU/mL，是正常對(duì)照組的41 858 倍；益生元發(fā)酵豆乳150 mL 組益生菌數(shù)量達(dá)到7.93×1013CFU/mL，是正常對(duì)照組的70 177 倍。因此，功能性SBOS 作為益生元對(duì)于干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)具有增殖作用，食用150 mL/d 大豆益生元發(fā)酵豆乳對(duì)該益生菌生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)增殖作用（t≤0.05）。

3 結(jié)論

按上述制備方法，采用干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌混種發(fā)酵大豆低聚糖，優(yōu)化大豆益生元發(fā)酵豆乳制備工藝。通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，制備大豆益生元發(fā)酵豆乳的最佳工藝條件，即干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌質(zhì)量比為1 ∶1、果膠的添加量為0.3%、豆粉與水的質(zhì)量體積比為1 ∶12（g/mL）、脫脂乳粉添加量為24%、SBOS 添加量為25%、接種量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時(shí)間為7 h、后熟18 h～24 h。此條件下制備的大豆益生元發(fā)酵豆乳凝乳堅(jiān)實(shí)、細(xì)膩、光滑，風(fēng)味及口感俱佳。食用150 mL/d 大豆益生元發(fā)酵豆乳對(duì)益生菌生長(zhǎng)增殖顯著，適于免疫力功能下降的老人、腹瀉或便秘人士食用，是一種可以調(diào)節(jié)腸道有益菌群平衡，保障人體健康的保健型發(fā)酵豆乳。