新型固體靶核素89Zr的制備、標記和臨床前應用研究進展

王 風，朱 華，李立強，郭曉軼，劉特立，楊 志

(北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所 核醫(yī)學科，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

以功能顯像為基礎的正電子計算機發(fā)射斷層掃描(PET/CT)，在提供病變解剖信息的同時還能提供病變的代謝和功能特征，可以動態(tài)監(jiān)測癌癥患者的靶向治療療效，并對治療效果提供療效評價，廣泛應用于癌癥的良惡性診斷、分期與再分期、療效及預后評價等[1-4]。將正電子核素與抗體靶向治療藥物相連接并進行PET顯像即為腫瘤抗體PET免疫顯像(immuno-PET)。PET免疫顯像能夠實時、在體的監(jiān)測腫瘤免疫治療藥物分子的體內分布、抗原-抗體結合和抗原特異性T細胞的生物學行為，是篩選適合抗體靶向治療的重要方法[5-6]。正電子核素鋯-89(89Zr)由于其較長的半衰期，能夠匹配抗體在體內代謝過程，使其成為PET免疫顯像的理想核素，同時89Zr還可以用于制備納米管、納米粒子和微球等，已經廣泛應用于臨床前研究[7-8]。雖然89Zr是良好的PET免疫顯像核素，但是國內尚未有廠家和機構能夠穩(wěn)定生產并提供89Zr，國內急需開展89Zr的制備、純化、標記顯像等基礎研究和初步實驗，以期能夠穩(wěn)定生產高質量的89Zr，并初步應用于臨床研究。本文對目前國內外固體靶制備89Zr核素、標記以及臨床應用進行簡要概述。

1 89Zr的性質

89Zr為正電子核素，通過電子俘獲和正電子衰變生成穩(wěn)定核素89Y(IEC=76.6%，Iβ+=22.3%，Emax(β+)=897 keV，Eγ=908.9 keV，Iγ=100%)，物理半衰期T1/2=78.41 h，可以匹配某些具有相似生物半衰期抗體在體內的代謝過程，從而進行抗體標記PET免疫顯像。而常用的正電子核素18F、11C、68Ga半衰期只有109.7、20、67.7 min，都是短壽命核素，核素在進入實體腫瘤之前就已經衰變完全，無法反映抗體在體內的代謝過程。89Zr還具有較低的正電子能量，正電子自由行程距離短，能夠提供較高的PET顯像空間分辨率[9-10]。89Zr以及相關正電子核素的性質列于表1。

表1 主要正電子核素性質

2 固體靶核素89Zr的制備

目前89Zr的生產主要通過回旋加速器產生質子或氘核轟擊89Y獲得，主要的兩個核反應為89Y(p,n)89Zr或89Y(d,2n)89Zr，89Y(p,n)89Zr核反應需要的質子能量較低而被廣泛使用，核反應最大截面約14 MeV。

89Zr的生產需要采用合理的靶裝載方式，合適的質子能量、束流大小和轟擊時間，以及選擇高效的分離方法等。由于不同回旋加速器的構造、設計和束流引出方式不同，需要根據回旋加速器的構造設計匹配的靶裝載方式；其次束流大小和轟擊時間不僅影響89Zr的產量，還關系靶室的散熱，要根據回旋加速器的散熱承載能力優(yōu)化回旋加速器轟擊參數；選擇快速高效的提純方法，以獲得高純度的產品，同樣是制備放射性藥物的關鍵。89Zr的制備流程主要包括：①靶的裝載；②回旋加速器的轟擊；③核素的提純。

2.1 靶的裝載方式

靶材料89Y常溫下為固體，通常將靶材料以薄膜、薄片、濺射鍍層或者電鍍的方式裝載到銅托或者鋁托上，不同的裝載方式具有不同的優(yōu)缺點。薄膜/薄片可以直接購買，裝載較為方便，但是產量略低，需要及時散熱；濺射鍍層的方式可以進行高束流長時間轟擊，但是制備方法略微復雜；使用電鍍的方法將靶材料沉淀到靶托上進行轟擊為一種創(chuàng)新方法，但是電鍍需要在無水溶液下進行，沉淀物的粘合度和均勻性值得研究。薄膜/薄片由于成本低廉，裝載方便，是目前最常使用的裝載方式。

2.2 回旋加速器照射參數

89Y(p,n)89Zr的核反應能量范圍5～15 MeV，合適的質子能量才能獲得最佳的核反應產額。質子束流從加速器引出時經過管道、碳膜、真空膜和靶材料等物質后會有能量損失，需要進行計算和實驗選擇合適的轟擊能量。同時轟擊時間越長、束流越大產量也會越高，但是會帶來加速器承載以及散射等問題，所以選擇合適的轟擊時間，束流能量和束流大小是89Zr生產的關鍵，不少研究機構通過蒙特卡羅方法進行模擬計算優(yōu)化回旋加速器轟擊參數，并進行實驗驗證。

2.3 核素提取和純化

89Y只有一種穩(wěn)定的同位素形式，但是89Y(p,n)89mZr,89Y(p,2n)88Zr,89Y(p,pn)88Y等副反應會引入雜質，同時制靶過程中使用的銅托或者鋁托會帶入微量的銅、鐵、鎳等元素，會對競爭性標記產生影響，必須清除，只有高純的89Zr才能進行有效的藥物標記。離子交換樹脂法簡單方便，已成為目前最常使用的分離提純方法。將89Zr/89Y混合溶液經過活化的異羥肟酸樹脂，并使用草酸溶液淋洗可得到高純度的89Zr溶液。

相關文獻報道的89Zr的制備方法和產量比較[11-18]列于表2。由表2可以看出，不同的制備工藝、轟擊參數和純化方法等直接決定89Zr的核素產量。

表2 89Zr的制備方法比較

3 89Zr標記抗體

3.1 標記配體

為了防止標記的核素從產物中脫落，降低脫落的Zr4+沉積到骨骼中產生輻射損傷，提高標記產物的穩(wěn)定性，89Zr標記需要使用合適的配體標記[19-20]。目前主要的配體有DTPA、EDTA、DFO等，以DFO標記的抗體最穩(wěn)定，為89Zr標記的常規(guī)配合物，使用DTPA等螯合劑其標記成功率小于0.1%。以DFO為配體的89Zr通用標記步驟如下：①使用Na2CO3或HEPES緩沖液調節(jié)89Zr的草酸溶液至最佳pH，pH標定范圍一般為6.8～7.2；②加入DFO共軛抗體在室溫下反應30～60 min；③純化后通過高效液相色譜等方法測量放射性標記產物的純度，進行穩(wěn)定性分析。

3.2 共軛連接

DFO可以通過幾種不同的共軛連接方式與抗體連接，不同的共軛連接方式不僅影響標記率的高低，也會影響標記產物的穩(wěn)定性質，進而反映抗體在體內的分布性質，所以不同的抗體需要選擇不同的共軛連接方法，才能使得標記分子探針安全可靠。一種方法是將DFO通過S-乙酰巰基乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate,SATA)修飾，產生受保護的巰基，并在抗體中引入馬來酰亞胺基團，在一定pH下形成連接有DFO的標記抗體[21]。而Verel等[22]開發(fā)的TFP-N-琥珀酸DFO(N-suc-DFO)方法，通過四氟苯酚(2,3,5,6-tetrafluorophenol, TFP)修飾DFO后進行抗體標記，勿需抗體修飾且標記穩(wěn)定。2010年Perk等[23]發(fā)明了經過改造的含異硫氰酸芐基(p-isothiocyanatobenzyl-bearing)DFO(DFO-BZ-NCS)標記方法，該方法簡單方便，而且螯合劑容易獲得，使其成為臨床最常使用的標記方法。

不同的共軛連接方法各有優(yōu)缺點，N-suc-DFO方法標記產物穩(wěn)定但標記步驟相對繁瑣，DFO-BZ-NCS方法標記更為方便但其水溶性較差。所以需要更多的專業(yè)研究選擇合適的共軛連接方法，標記方便且安全可靠的標記產物。

4 89Zr的臨床前應用

4.1 89Zr標記抗體PET免疫顯像

目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經批準上市了多種免疫治療藥物，如抗體類治療藥物：曲妥珠單抗Ado-trastuzumab emtansine(Kadcyla)，本妥昔單抗Brentuximab vedotin(Adcetris)和替伊莫單抗Ibritumomab tiuxetan(Zevalin)等；以及免疫位點抑制劑，Ipilimumab(Yervoy)針對CTLA-4，Nivolumab(Opdivo)和pembrolizumab(Keytruda)針對PD1等[24]。新的治療靶點和新的聯合用藥方案是目前研究的熱點，許多研究機構已經開展了多項89Zr標記單抗的臨床前應用研究，用以分析抗體藥物在體內的代謝過程，評估腫瘤治療療效。有些研究已經進行了臨床轉化實驗，使用89Zr標記抗體進行PET免疫顯像已經顯現了其在免疫治療中的巨大潛力[25-26]。用于臨床(或臨床前)研究的89Zr免疫顯像抗體列于表3。

表3 用于臨床(或臨床前)研究的89Zr免疫顯像抗體

應用固體靶核素89Zr的PET免疫顯像臨床前及臨床中的研究表明，89Zr免疫顯像能夠充分反映抗體在腫瘤患者體內的分布和代謝情況，可通過PET顯像直觀地呈現抗體免疫治療的靶點是否作用于腫瘤特定部位，并觀測抗體免疫治療的治療效果，89Zr標記抗體PET免疫顯像對免疫治療的主要作用和優(yōu)勢如下：1)89Zr具有較長的半衰期，與腫瘤部位特異性結合，能較長時間(一周以上)進行多次PET顯像，而常規(guī)的18F-FDG無法勝任；2)89Zr相較于124I、64Cu發(fā)射的正電子能量較低，對組織損傷較小，更加安全，并且PET圖像分辨率更好，能夠在低注射量下更清晰的顯示病灶；3) 為在體無創(chuàng)檢測方法，無需進行組織穿刺等有創(chuàng)操作；4) 能反映受檢者全身整體的藥物代謝分布情況，能夠提示遠端轉移的微小病灶或者淋巴結轉移；5) 分子影像能夠提示病灶成分的腫瘤異質性特征，通過影像學特征分析能進一步揭示腫瘤的內部微小信息；6) 影像檢查可以方便地對免疫治療后的患者進行療效評價，指導治療方案的制定和優(yōu)化。

4.2 89Zr非抗體標記應用

89Zr除了用于抗體標記外，還被用于標記制備納米粒子、納米管和微球等[27-31]。譬如90Y微球可以進行許多腫瘤的內照射治療，使用89Zr標記的微球預先對腫瘤部位進行PET在體顯像，精確勾畫腫瘤靶區(qū)范圍，進行治療劑量計劃計算，優(yōu)化治療流程，也可以進行療效評估。相較于其他核素標記，89Zr(T1/2=78.4 h)和89Y(T1/2=64.1 h)具有近似的半衰期，進行PET顯像效果更顯著。

89Zr標記的白蛋白納米膠體(89Zr-DFO-albumin)可以有效進行前哨淋巴結檢測，甚至可以在原發(fā)腫瘤周圍快速準確找到轉移的前哨淋巴結，其臨床檢測效果要比99mTc標記的白蛋白納米膠體可靠。89Zr標記的短鏈葡聚糖納米粒子(DNPs)可以進行巨噬細胞和炎癥顯像，其較長的半衰期可以在藥物注射24 h內有效地監(jiān)測腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)狀態(tài)，指導腫瘤的臨床診斷和治療。89Zr還可以用于單壁碳納米管(SWCNT)的標記，標記物具有較大的表面積和低免疫原性，相關研究機構報道了89Zr碳納米管衍生物與腫瘤新生血管靶向抗體E4G10的標記，并進行了荷瘤小鼠體內PET顯像和評價，能夠特異性的快速顯示腫瘤位置。89Zr還可用于脂質體的標記，聯合89Zr標記的生長抑素受體奧曲肽脂質體和釓離子還可以進行PET/MRI多模態(tài)影像檢查。

此外，89Zr還可以用于部分多肽和抗體片段的標記，但是由于多肽等小分子在體內的清除率較快，多數使用短半衰期的核素(18F、68Ga等)進行標記，而只有觀察一些大的多肽聚合物在體內的藥代動力學過程才使用89Zr標記。

5 小結

89Zr的PET免疫顯像在腫瘤抗體免疫診斷治療中顯現了重要作用，較長的半衰期能夠與抗體在體內的代謝過程很好的契合，標記抗體能夠特異性、靶向性的指示腫瘤的代謝特征，有效進行腫瘤適應癥篩選和療效評估。

雖然國外許多機構已經開展89Zr的生產及應用，但是目前國內還沒有機構或者廠家可以穩(wěn)定提供高純度89Zr核素，快速、方便的獲得高純度89Zr和標記產物是開展臨床應用的重要前提。