靶向CD93分子探針制備及其生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

劉偉偉，梁 婷，張 超，曹 慧，侯桂華

(山東大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)同位素研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病隱匿，發(fā)病率和死亡率逐年增加，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，因此早期診斷對(duì)于肺癌患者干預(yù)治療和預(yù)后至關(guān)重要[1]。目前常用診斷手段，除臨床癥狀外，主要包括CT、MR、核醫(yī)學(xué)顯像和血清腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)等，但均缺乏特異性，難以揭示組織特異性病變。分子影像學(xué)在尚未發(fā)生解剖學(xué)改變前即可檢出異常，為分子水平疾病的治療奠定基礎(chǔ)，其顯像的關(guān)鍵是尋找高特異性和高敏感性的分子探針，因此肺癌早期診斷及靶向治療的生物標(biāo)志物成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[2]。放射性核素顯像可在分子水平實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)性監(jiān)測(cè)疾病發(fā)生發(fā)展，可在疾病早期提供功能代謝方面改變的信息，因此臨床亟需高特異性肺癌靶向的分子探針，對(duì)肺癌疾病進(jìn)行早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后，并為個(gè)體化靶向治療提供基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道，利用肺癌細(xì)胞表面表達(dá)的分子標(biāo)志物，如14C5[3]，α3β1[4]進(jìn)行放射性核素標(biāo)記可以進(jìn)行肺癌診斷及療效評(píng)價(jià)，但特異性不高，靶向性不強(qiáng)，臨床潛在應(yīng)用有局限性。

血管生成參與多種生理病理過(guò)程，在實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[5]。近年來(lái)靶向腫瘤新生血管已成為臨床腫瘤靶向診斷及治療的重要手段[6]。研究較多的顯像劑有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受體顯像[7-8]、整合素αvβ3小分子多肽顯像[9]、氨肽酶N(CD13)受體顯像[10]。目前應(yīng)用于臨床的靶向VEGF藥物如貝伐珠單抗已取得明顯療效[11]，提示新生血管生成在肺癌發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。然而報(bào)道的靶向新生血管的膜分子相關(guān)分子探針缺乏高特異性和高選擇性。CD93是一種跨膜糖蛋白，主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、干細(xì)胞及骨髓細(xì)胞(粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)，由細(xì)胞外部分組成，包括C型凝集素結(jié)構(gòu)域、5個(gè)EGF樣重復(fù)序列、富含絲氨酸/蘇氨酸的粘蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和含有moesin結(jié)合位點(diǎn)的短細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。早期研究表明CD93是免疫分子，參與免疫細(xì)胞的黏附和穿越。目前文獻(xiàn)報(bào)道CD93是一種新型血管生成激活劑，主要通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附促進(jìn)腫瘤血管再生[12]，影響腫瘤的生長(zhǎng)。Elise等[13]報(bào)道血管CD93高表達(dá)與高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的低存活率有關(guān)，Renate等[14]報(bào)道CD93基因多模態(tài)與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，Bao等[15]研究發(fā)現(xiàn)CD93高表達(dá)促進(jìn)了鼻咽癌患者血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。CD93在腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，在非增殖的內(nèi)皮細(xì)胞低表達(dá)[16]。CD93作為一種癌癥相關(guān)蛋白，通過(guò)參與血管生成和細(xì)胞增殖促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展，最近研究已將CD93鑒定為人原發(fā)性腫瘤血管生成特征的前20個(gè)核心基因之一[17]，與相對(duì)應(yīng)的正常組織相比，癌組織CD93顯著高表達(dá)。肺癌腫瘤組織是否表達(dá)CD93分子，臨床上常規(guī)采用免疫組化分析。與免疫組化侵襲性檢查相比，分子顯像是一種非侵入式的全身動(dòng)態(tài)掃描，更適合用于肺癌組織中CD93表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)。因此推測(cè)CD93有可能作為腫瘤新生血管發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子，有望用于CD93陽(yáng)性腫瘤的早期靶向診斷。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)以CD93分子作為分子靶點(diǎn)，進(jìn)行腫瘤監(jiān)測(cè)及療效評(píng)價(jià)的研究報(bào)道。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器及試劑

Na125I 溶液：美國(guó)PerkinElmer 公司產(chǎn)品，由中國(guó)同輻有限公司提供；Iodogen(1，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)：美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液：美國(guó) HyClone 公司；凝膠色譜柱 PD-10：美國(guó)GE Healthcare Life Sciences公司；CD93單克隆抗體(bs-10232R)：Bioss公司提供；γ計(jì)數(shù)儀：美國(guó)CAPINTEC公司產(chǎn)品；薄層放射層析儀(TLC)：美國(guó)Bioscan公司產(chǎn)品；Cyclone Plus磷屏掃描系統(tǒng)：美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 細(xì)胞株

肺癌A549細(xì)胞由山東大學(xué)生物醫(yī)學(xué)同位素研究中心保存，解凍后置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c裸鼠，雌性，體重18～22 g，4～6周齡。由北京維通利華公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)：ECSBM SSDU2018-2-014。飼養(yǎng)所用材料及物品均經(jīng)高壓滅菌處理。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)記物的制備、放化純度及穩(wěn)定性鑒定

125I-anti-CD93 mAb(同種型125I-IgG)的制備：按照常規(guī)Iodogen 法標(biāo)記抗CD93單抗(或等量同種型IgG) ,并用PD-10凝膠柱純化。本次實(shí)驗(yàn)使用抗CD93單抗(或同種型IgG)抗體10 μg(1 g/1 L) ，Na125I溶液12 MBq。用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算125I-anti-CD93 mAb(125I-IgG) 標(biāo)記率和比活度。采用紙層析法分析放化純度。Whatman No.1 濾紙為支持物，0.9%生理鹽水和甲醇(1∶2)混合液為展開(kāi)劑。

體外穩(wěn)定性分析：采用紙層析法于24、48、72 h測(cè)量標(biāo)記物在生理鹽水(NS)、人血清(serum)的穩(wěn)定性。

2.2 肺癌荷瘤小鼠模型的建立

待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化、傳代，至細(xì)胞擴(kuò)增至所需數(shù)量，收集呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×107/mL,將細(xì)胞懸液接種于BALB/c裸鼠右前肢肩部皮下，0.2 mL/只，建立荷瘤動(dòng)物模型，共40只。所有操作均在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。建模后常規(guī)飼養(yǎng)，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大徑，待其最大徑達(dá)0.8～1.0 cm時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 體外細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞(2×105/孔)接種于24孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；按濃度梯度(3～100 nmol/L)加125I-anti-CD93 mAb，于37 ℃孵育2 h，移除上清液，冰PBS洗滌兩次，1 mol/L NaOH裂解細(xì)胞，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量裂解液放射性計(jì)數(shù)。

阻斷實(shí)驗(yàn)：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞(2×105/孔)接種于24孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；加入125I-anti-CD93 mAb(20 nmol/L)及未標(biāo)記的抗CD93抗體(0、1.42、14.20、28.40 nmol/L)，于37 ℃孵育2 h，移除上清液，冷PBS洗滌兩次，1 mol/L NaOH裂解細(xì)胞, 用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量裂解液放射性計(jì)數(shù)。

2.4 荷瘤鼠體內(nèi)生物學(xué)分布

隨機(jī)選取30只荷瘤鼠，提前 48 h用 3%(w/v)的NaI溶液封閉甲狀腺。分別經(jīng)尾靜注射125I-anti-CD93 mAb或125I-IgG， 0.37 MBq/只，注射后24、48、72 h，每組隨機(jī)選取5只小鼠摘眼球取血，并將小鼠脫椎處死，取骨、腎、脾、甲狀腺、肝、腸、心、肺、腫瘤及腫瘤對(duì)側(cè)肌肉稱重并測(cè)定其放射性(cpm)。計(jì)算腫瘤(T)與對(duì)側(cè)肌肉組織(NT)的放射性計(jì)數(shù)比值(T/NT)。測(cè)定注射標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)源的放射性，計(jì)算每克組織或器官的放射性占標(biāo)準(zhǔn)源放射性的百分比(%ID/g)。

2.5 荷瘤鼠全身動(dòng)態(tài)磷屏自顯影

將10只荷瘤鼠隨機(jī)分為2組，分別經(jīng)尾靜脈注射125I-anti-CD93 mAb或125I-IgG， 0.37 MBq/只，注射后24、48、72 h用0.6%戊巴比妥鈉麻醉，將其腹側(cè)朝上，背側(cè)緊貼磷屏采集板，四肢伸直并用膠帶固定，暗處理20 min后，迅速將磷屏放于掃描儀進(jìn)行圖像采集。使用 OptiQuantTM圖像分析軟件對(duì)比分析上述掃描圖像：在每張圖像的感興趣區(qū)(regions of interest, ROI)選取矩形區(qū)域，利用軟件測(cè)定每個(gè)區(qū)域中每平方毫米的數(shù)字光單位 DLU/mm2(digital light units per mm2),計(jì)算腫瘤部位的放射性比活度與其對(duì)側(cè)肌肉區(qū)域的放射性比活度的比值。

2.6 HE染色及免疫組織化學(xué)染色

隨機(jī)選取磷屏自顯影顯像后的荷瘤鼠并處死，分離出腫瘤組織，置于4%的多聚甲醛固定24 h，將固定好的組織制成石蠟切片，按試劑盒要求進(jìn)行HE染色及CD93免疫組織化學(xué)染色。將樣本片置于光學(xué)顯微鏡下，在200×視野下觀察拍照，每張標(biāo)本片隨機(jī)選擇多個(gè)視野，計(jì)算CD93染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 探針制備及穩(wěn)定性分析

成功制備125I-anti-CD93 mAb和125I-IgG。兩種標(biāo)記物洗脫曲線均可顯示其蛋白峰和游離峰。125I-anti-CD93 mAb的標(biāo)記率為91.37%，放射性比活度為1 096.44 MBq/mg。125I-IgG標(biāo)記率為90.24%，放射性比活度為1 082.88 MBq/mg。125I-anti-CD93 mAb 和125I-IgG 的放化純度分別為96.49%、94.82%。兩種標(biāo)記物的標(biāo)記率、放射性比活度及放化純度無(wú)顯著差異，P>0.05。將125I-anti-CD93 mAb和125I-IgG在室溫下放置24、48、72 h后，紙層析法測(cè)得其穩(wěn)定性結(jié)果示于圖1，在生理鹽水(NS)和人血清(serum)中兩種標(biāo)記物穩(wěn)定性好，至 72 h仍維持在 90%以上，且血清及生理鹽水組未見(jiàn)明顯差異。兩種標(biāo)記物的穩(wěn)定性無(wú)顯著差異。

3.2 125I-anti-CD93 mAb結(jié)合、阻斷分析

細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果示于圖2a，A549 細(xì)胞對(duì)125I-anti-CD93 mAb親和力較好，Kd值為27.09 nmol/L。阻斷實(shí)驗(yàn)分析示于圖2b， CD93抗體對(duì)A549細(xì)胞與125I-anti-CD93 mAb結(jié)合的阻斷率分別為24%、49%、60%，抗體的含量與阻斷率成正比，顯示未標(biāo)記抗CD93 mAb與A549細(xì)胞可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記物125I-anti-CD93 mAb，結(jié)果提示125I-anti-CD93 mAb對(duì)A549細(xì)胞具有靶向性，CD93分子可作為監(jiān)測(cè)A549肺癌的分子靶點(diǎn)。

圖1 穩(wěn)定性分析

圖2 體外結(jié)合及阻斷分析

3.3 探針在A549肺癌荷瘤鼠模型中生物學(xué)分布

經(jīng)尾靜脈給荷瘤鼠分別注射125I-anti-CD93 mAb和125I-IgG ，于24、48、72 h處死小鼠，收集主要器官及組織，稱重，并測(cè)量其放射性，分析標(biāo)記物在體內(nèi)的生物學(xué)分布狀況。注射后48 h體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果列于表1，可見(jiàn)兩標(biāo)記物生物學(xué)分布趨勢(shì)大致相同，腎、肝、脾放射性計(jì)數(shù)較高，提示標(biāo)記物主要經(jīng)肝腎排泄；腫瘤處放射性計(jì)數(shù)高，而封閉的甲狀腺、骨、肌肉、血放射性計(jì)數(shù)較低。注射48 h后125I-anti-CD93 mAb和125I-IgG腫瘤放射性攝取分別為(6.42±0.71)%ID/g和(2.45±0.33)%ID/g，前者明顯高于后者(P<0.05)。兩種標(biāo)記物在模型鼠體內(nèi)T/NT(腫瘤/對(duì)側(cè)肌肉組織)放射性攝取比示于圖3,125I-anti-CD93 mAb和125I-IgG注射后 24、48、72 h T/NT比值分別為(2.42±0.14)/(1.30±0.02)，(4.45±0.86)/(1.71±0.24)和(2.69±0.13)/(1.68±0.25)，48 h兩標(biāo)記物T/NT比值差異最為明顯(P<0.05)。結(jié)果表明，與對(duì)照組125I-IgG相比，CD93靶向探針注射后肺癌腫瘤放射性濃聚明顯高于對(duì)照組125I-IgG，且在注射后48 h腫瘤放射性計(jì)數(shù)最高，同時(shí)T/NT比值最高。兩標(biāo)記物注射后模型鼠不同器官與血的放射性攝取比示于圖4，125I-anti-CD93 mAb標(biāo)記物注射后72 h靶/血比值為4.32±0.20，125I-IgG僅為1.10±0.12，表明125I-anti-CD93 mAb在腫瘤部位特異性分布；兩標(biāo)記物腎/血、肝/血、脾/血比值之間無(wú)明顯差異。

表1 標(biāo)記物在荷瘤鼠體內(nèi)生物學(xué)分布

圖3 標(biāo)記物注射后不同時(shí)間靶與非靶放射性攝取比

3.4 荷瘤鼠動(dòng)態(tài)全身磷屏自顯影

125I-anti-CD93 mAb注射組磷屏自顯影顯像結(jié)果示于圖5a。注射24 h后，小鼠輪廓清晰可見(jiàn)，但本底較高；48 h時(shí)可見(jiàn)腫瘤部位有明顯放射性濃聚，而對(duì)側(cè)肌肉組織則未見(jiàn)放射性濃聚，兩者之間差異明顯。72 h時(shí)小鼠腫瘤放射性濃聚程度下降，小鼠輪廓僅隱約可見(jiàn)。125I-IgG注射組自顯影結(jié)果示于圖5b，注射顯像劑24 h后，小鼠輪廓清晰，無(wú)明顯特異性濃聚；48 h可見(jiàn)腫瘤放射性濃聚，但較125I-anti-CD93 mAb組低，且對(duì)側(cè)肌肉組織亦未見(jiàn)放射性濃聚，腫瘤組織和對(duì)側(cè)肌肉間顯像差異不明顯。72 h小鼠顯像接近本底。

圖4 標(biāo)記物注射后不同時(shí)間不同器官與血的放射性攝取比

圖5 荷瘤鼠磷屏自顯影顯像

經(jīng)放射性濃聚半定量分析磷屏自顯影顯像結(jié)果，125I-anti-CD93 mAb注射組48 h腫瘤顯像最為清晰，該時(shí)間點(diǎn)腫瘤放射性活度值為(76 740±3 430) DLU/mm2，而對(duì)側(cè)肌肉組織為(23 020±581.8) DLU/mm2。125I-IgG組腫瘤未見(jiàn)明顯的放射性濃聚。125I-anti-CD93 mAb 48 h腫瘤放射性活度比最高3.34±0.18，而24、72 h分別為1.37±0.17和1.67±0.09。125I-IgG注射組24、48、72 h腫瘤放射性活度比分別為1.23±0.02、1.62±0.19、1.17±0.04。

3.5 腫瘤組織HE染色及CD93免疫組織化學(xué)染色

荷瘤鼠腫瘤組織HE及CD93免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示于圖6。腫瘤組織高表達(dá)CD93(棕色)，主要在膜上，陽(yáng)性率為(59.22±0.28)%。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與磷屏自顯影顯像中CD93靶向標(biāo)記物腫瘤放射性高濃聚狀況一致。

圖6 腫瘤組織HE(a)及CD93免疫組化(b)染色(200×)

4 討論

肺癌死亡率居全球惡性腫瘤首位，早期階段癥狀很少或缺乏，一般確診時(shí)間都為晚期。早期診斷早期治療是提高生存率的關(guān)鍵。18F-FDG作為一種葡萄糖代謝顯像劑，常出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，從而使得對(duì)腫瘤的監(jiān)測(cè)缺乏特異性。因此尋找新型分子靶點(diǎn)進(jìn)行核素分子顯像研究，有可能為肺癌的分子診斷和治療提供新的手段。血管生成是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟[18]，CD93作為在血管內(nèi)皮中優(yōu)先表達(dá)的高度糖基化跨膜蛋白，參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管生成。因此CD93有望成為早期肺癌監(jiān)測(cè)的分子靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，A549肺癌細(xì)胞系高表達(dá)CD93分子。為證實(shí)制備的分子探針125I-anti-CD93 mAb對(duì)A549肺癌體內(nèi)體外均具有良好的靶向性，本文設(shè)計(jì)兩個(gè)對(duì)照：一是體內(nèi)探針利用同種型125I-IgG，二是體外阻斷實(shí)驗(yàn)。本研究使用的CD93單抗雖為大分子蛋白，但荷瘤鼠體內(nèi)生物學(xué)分布和放射自顯影影像研究結(jié)果都證實(shí)，在注射碘標(biāo)記物24 h后，顯像劑即可到達(dá)腫瘤部位，表明標(biāo)記物可參與荷瘤鼠體內(nèi)代謝，可在腫瘤部位濃聚，這使利用CD93作為分子靶點(diǎn)，對(duì)肺癌早期監(jiān)測(cè)成為可能。125I-anti-CD93 mAb能夠在肺癌聚集，與肺癌高表達(dá)CD93直接相關(guān)，證實(shí)是一種CD93特異性腫瘤靶向分子探針。

本文研究中發(fā)現(xiàn)，荷瘤鼠肺、心臟放射性計(jì)數(shù)較低，接近本底，這對(duì)降低本底干擾，更有利于對(duì)肺癌的靶向診斷具有重要意義。需要指出的是本文僅研究了125I-anti-CD93 mAb在A549細(xì)胞荷瘤模型中的生物學(xué)分布和腫瘤靶向性，下一步需要對(duì)CD93表達(dá)水平不同的多種肺癌細(xì)胞系進(jìn)行深入研究。此外CD93單抗相對(duì)分子質(zhì)量大，放射性碘標(biāo)記分子在生物體內(nèi)易解離，下一步將選擇新的核素以及抗CD93小分子抗體片段，對(duì)CD93靶向分子進(jìn)行標(biāo)記和進(jìn)一步體內(nèi)靶向研究。

5 小結(jié)

本研究成功制備一種新型分子探針125I-anti-CD93 mAb，制備方法簡(jiǎn)便，標(biāo)記率及放化純度均較高，在血清及生理鹽水中穩(wěn)定性較好，并首次研究了該探針對(duì)人肺癌A549荷瘤鼠模型腫瘤的靶向監(jiān)測(cè)性，為以CD93為靶點(diǎn)對(duì)肺癌進(jìn)行診斷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因此對(duì)于肺癌的診斷可能具有潛在應(yīng)用價(jià)值，并有望用于其他CD93表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤顯像，值得進(jìn)一步深入研究。