添加枯草芽孢桿菌對桑青貯發(fā)酵品質(zhì)的研究

朱佳文， 李峪鵬， 許禎瑩， 李 娟， 蘇志鵬， 雷春龍，劉瀚揚， 徐麒麟， 陳亞迎， 吳永勝， 曹衍波， 邱時秀*

（1.成都市農(nóng)林科學院畜牧研究所，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川成都 611130；3.四川特驅(qū)投資集團有限公司，四川成都 610207）

桑的營養(yǎng)價值非常豐富，其含有20%～30%的蛋白質(zhì)，2.7%～3.1%的礦物質(zhì)元素和4.1%～7.4%的維生素及高含量的γ-氨基丁酸。據(jù)報道，桑葉還含有蘆丁、槲皮素、異槲皮素、脫氧野尻毒素等天然活性物質(zhì)（Yoshikumi，1988）。 因此，不僅可以作為藥用保健品，還由于其產(chǎn)量高等因素，目前也被廣泛應(yīng)用于動物飼料中。

枯草芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌，安全無毒副作用。有研究發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌等菌株青貯后的玉米秸稈色澤和結(jié)構(gòu)與原料相似，霉變程度得到改善，感官評定優(yōu)良（任付平，2007）。 Shi等（2017）利用枯草芽孢桿菌作為玉米-豆粕的固體發(fā)酵菌種發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的飼料粗蛋白質(zhì)含量升高，小分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸提高3倍以上，和糞腸球菌一起飼喂動物可以顯著提高飼料的消化率。發(fā)酵過程中添加芽孢桿菌可能在抑制有害細菌生長方面起到關(guān)鍵作用，能維持動物腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，還能刺激胰酶分泌，促進維生素和礦物質(zhì)的吸收（ás wi，atkiewicz等，2010；Wang等，2009）。

本試驗從桑葉種植地收集土樣，對樣品中的菌株進行分離培養(yǎng)，并通過生化和分子生物學特性的鑒定，篩選出一株枯草芽孢桿菌（命名為BSKC）用于發(fā)酵桑青貯飼料，旨在為利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)飼料桑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗所用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）來自成都市農(nóng)林科學院分離鑒定菌株，命名為BS-KC；桑取自成都市農(nóng)林科學院羊馬科研實驗基地，于2018年7月采收；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；青貯飼料發(fā)酵袋規(guī)格為30 cm×40 cm，22絲；生化鑒定管購自海博生物技術(shù)有限公司；提取細菌基因組試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；PCR相關(guān)試劑購自寶日生物技術(shù)有限公司。

1.2 細菌的分離鑒定

1.2.1 細菌的分離 稱取飼料桑周圍土壤100 g，置于裝有900 mL無菌PBS的燒杯中，混勻，即為稀釋10倍的樣品懸液。置于80℃水浴鍋20 min后，取100μL進行倍比稀釋，涂布于TSA平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取疑似芽孢桿菌單菌落進行16SrRNA鑒定。

1.2.2 形態(tài)鑒定 將新鮮菌液固定于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后，通過光鏡觀察菌落形態(tài)。同時，將新鮮菌液進行倍比稀釋后，涂布于TSA平板，37℃培養(yǎng)16 h，觀察平板上的菌落形態(tài)。

1.2.3 分子鑒定 根據(jù)引物 27F：5’-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’，1492R：5’ -GGTTA CCTTGTTACGACTT-3’擴增細菌16SrRNA，擴增細菌基因片段大小約為1400 bp；根據(jù)B.Subtilis特 異 性 引 物 BS-F：5’-CCAGT AGCCA AGAAT GGCCA GC-3’，BS-R：5’ -GGAAT AATCG CCGCTTTGTGC-3’（Ashe 等，2014），擴增枯草芽孢桿菌基因片段大小為1131 bp。細菌基因組提取參照康為世紀CW0552S產(chǎn)品說明書。PRC反應(yīng)體系：Premix Taq 10 μL；10 μmol/L Primer-F/R各1μL；基因組1μL；H2O 7μL。PCR反應(yīng)條件：（1）98 ℃ 5 min；（2）98 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃45 s，循環(huán) 30 次；（3）72 ℃ 10 min；（4）4 ℃ ∞。

1.2.4 生化鑒定 使用海博生物技術(shù)有限公司的細菌微量生化鑒定管進行分析。

1.2.5 供試菌種的生長曲線 采用常規(guī)的微生物培養(yǎng)、活化及擴大培養(yǎng)法。疑似菌落于37℃用TSB或TSA復蘇擴大培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。次日，取新鮮菌液100μL加入5 mL TSB培養(yǎng)基中，每隔1 h吸取100μL菌液進行倍比稀釋，涂布于TSA平板，置37℃培養(yǎng)計數(shù)，另取100 μL菌液進行OD600吸光度檢測。

1.3 青貯桑試驗設(shè)計 青貯窖采用青貯飼料發(fā)酵袋，將新鮮桑葉和葉柄切成3～5 cm左右，混勻，隨機分為30袋，每袋1000 g。對照組（C組）和處理組 （BS-KC組）每個發(fā)酵時間點各3袋，其中，BS-KC組B.subtilis添加量水平為5×106cfu/g桑鮮重，充分混勻，人工壓實后系上袋口，并用膠帶密封，置于室溫發(fā)酵。在青貯后第7、14天和28天打開發(fā)酵袋，分析青貯飼料各項指標。

1.4 發(fā)酵飼料樣品處理 分別在青貯后不同發(fā)酵時間點，隨機取出C組3袋和BS-KC組3袋，每袋稱取20 g放入250 mL錐形瓶，加入100 mL去離子水，4℃浸提24 h，先用雙層紗布過濾，再用濾紙過濾，測定pH后，將濾液分裝5管，凍于-20℃冰箱用于氨態(tài)氮的測定。將剩余的青貯飼料烘干，稱重，測定pH、干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、粗纖維和氨態(tài)氮含量。

1.5 測定指標及方法 水分含量測定參照GB/T 6435-2006《飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測定》；粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法，參照GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》；粗脂肪含量測定采用索氏提取法，參照GB/T 6433-2006《飼料中粗脂肪的測定方法》；粗灰分含量測定采用灼燒法，參照GB/T 6438-2007《飼料中粗灰分的測定方法》；粗纖維含量測定采用消煮法，參照GB/T 6434-2006《飼料中粗纖維的測定方法》；氨態(tài)氮含量利用苯酚-次氯酸鈉比色法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 細菌的分子鑒定結(jié)果 通過引物27F和1492R擴增細菌的16SrRNA，如圖1-A所示，并回收核酸片段進行測序比對分析，疑似單菌落為芽孢桿菌屬。通過特異性引物BS-F和BS-R鑒定菌落疑似為枯草芽孢桿菌，如圖1-B所示。

2.1.2 細菌的形態(tài)和生長曲線 疑似單菌落在TSA平板上分離純化后生長良好，菌落粗糙、不透明、擴張、中間有褶皺、微微帶黃色。通過光鏡觀察，該菌落為革蘭氏陽性菌，呈桿狀。通過對BSKC的生長曲線進行繪制，發(fā)現(xiàn)新鮮菌液培養(yǎng)8 h之后進入穩(wěn)定期，細菌OD600值可達1.1（圖2-a），細菌數(shù)可達 4×108cfu/mL（圖 2-b）。

2.1.3 細菌的可適生長溫度和pH 由表1可知，BS-KC能在15～75℃內(nèi)生長，也能在pH為5.5～7.5下生長，說明該BS-KC的生長范圍很廣，耐受能力很強。

表1 枯草芽孢桿菌BS-KC的可適生長溫度和pH

2.1.4 細菌的生化鑒定結(jié)果 通過對BS-KC進行糖發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)，該菌可以代謝阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖、纖維二糖、山梨醇和蔗糖等，不能代謝乳糖、棉子糖、鼠李糖和木糖等。通過西蒙氏枸櫞酸鹽試驗發(fā)現(xiàn)，該菌不能在枸櫞酸鹽中生長。通過H2S測定試驗發(fā)現(xiàn)，該菌不能產(chǎn)生H2S氣體。通過明膠測定試驗發(fā)現(xiàn)，該菌不能分解明膠。

表2 枯草芽孢桿菌BS-KC的生化試驗鑒定表

2.2 青貯桑營養(yǎng)成分的鑒定

2.2.1 BS-KC對桑青貯過程中pH的影響 由表3可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的pH和對照組無明顯差異。

表3 BS-KC對桑青貯過程中p H的影響

2.2.2 BS-KC對桑粗纖維的影響 由表4可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗纖維含量在發(fā)酵第14天后顯著低于對照組。

表4 BS-KC對桑葉青貯過程中粗纖維的影響%

2.2.3 BS-KC對桑粗脂肪的影響 由表5可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗脂肪含量在發(fā)酵第14天后顯著低于對照組。

表5 BS-KC對桑青貯過程中粗脂肪的影響%

2.2.4 BS-KC對桑粗灰分的影響 由表6可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗灰分含量和對照組差異不顯著。

表6 BS-KC對桑青貯過程中粗灰分的影響%

2.2.5 BS-KC對桑干物質(zhì)的影響 由表7可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的干物質(zhì)含量在發(fā)酵第7天后顯著高于對照組。

表7 BS-KC對桑葉青貯過程中干物質(zhì)的影響%

2.2.6 BS-KC對桑粗蛋白質(zhì)的影響 由表8可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的粗蛋白質(zhì)含量和對照組差異不顯著。

表8 BS-KC對桑葉青貯過程中粗蛋白質(zhì)的影響%

2.2.7 BS-KC對桑氨態(tài)氮/總氮的影響 由表9可知，桑青貯發(fā)酵過程中，添加BS-KC菌劑試驗組的氨態(tài)氮/總氮比值在發(fā)酵第7天后顯著低于對照組。

3 討論

3.1 分子試驗結(jié)合生化試驗對菌株的分析 發(fā)酵被廣泛地應(yīng)用在生產(chǎn)人類和動物健康的食物上，有研究表明發(fā)酵可以提高飼料原料的營養(yǎng)水平，例如棉籽粕、豆粕、干酒槽和木薯殘留物等。目前市場上用于飼料發(fā)酵的菌劑主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌。

表9 BS-KC對桑葉青貯過程中氨態(tài)氮/總氮的影響g/kg TN

通過細菌通用引物27F/1492R和特異性引物BS-F/R對分離的菌株進行16SrDNA的擴增，初步鑒定該菌為枯草芽孢桿菌，命名為BS-KC。并結(jié)合傳統(tǒng)的細菌光鏡觀察、可適生長范圍和生化試驗對其進行鑒定，通過《伯杰細菌鑒定手冊》確定菌株為枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是國家《飼料添加劑品種目錄（2013）》公布的可以用于動物飼養(yǎng)的一種微生物?？莶菅挎邨U菌在青貯玉米的過程中可以不減少飼料營養(yǎng)成分，并且可以改變青貯質(zhì)量（任付平，2007）?？莶菅挎邨U菌還能發(fā)酵玉米-豆粕，使飼料粗蛋白質(zhì)含量增加（Shitffu，2017）。因此，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑發(fā)酵青貯飼料有非常廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 添加枯草芽孢桿菌對青貯桑飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響 飼料的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗灰分等指標可用于評價青貯飼料的營養(yǎng)性質(zhì)；而氨態(tài)氮/總氮的比值，則是評估蛋白質(zhì)破壞程度最有效的指標；pH是衡量青貯飼料品質(zhì)好壞的重要指標之一。試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過28 d的青貯桑飼料，BS-KC組和C組的pH變化不大，可能是由于枯草芽孢桿菌對青貯飼料的pH沒有影響，不會像乳酸菌添加劑一樣明顯改變青貯飼料的pH。試驗粗蛋白質(zhì)的含量變化不大，沒有出現(xiàn)顯著差異，說明該BS-KC對青貯桑的蛋白質(zhì)含量沒有顯著影響。

本研究篩選的BS-KC可能含有纖維素酶活性和脂肪酶活性。飼料中的粗纖維和粗脂肪被枯草芽孢桿菌大量降解，導致青貯14 d后，BS-KC組的粗纖維和粗脂肪含量明顯低于C組，這可以改善青貯桑的適口性，提高飼料的消化利用率。有研究報道，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶類，可以分解桑葉中的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等，形成動物容易吸收的小分子物質(zhì)，也可以減少抗營養(yǎng)因子（ANFs）的含量，提高飼料的營養(yǎng)價值（Kiers等，2000）。 Yang等（2016）指出發(fā)酵過程中可溶性總糖和粗脂肪含量顯著減少，可能是由于被加入的地衣芽孢桿菌利用，這可能是本試驗中粗脂肪減少的一個原因。同時，枯草芽孢桿菌大量繁殖可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物和菌體蛋白，這可能是干物質(zhì)含量增加的原因。氨態(tài)氮/總氮的比值可反映青貯飼料中氨基酸和蛋白質(zhì)的分解程度，比值越小，說明氨基酸和蛋白質(zhì)分解得越少。 當發(fā)酵第 7、14、28天，BS-KC 組的氨態(tài)氮/總氮的比值均明顯低于C組，說明添加枯草芽孢桿菌之后，青貯桑的質(zhì)量和飼料的消化利用率明顯提高。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在桑葉青貯過程中添加枯草芽孢桿菌BS-KC發(fā)酵14 d，飼料中干物質(zhì)含量略有增加，粗纖維和粗脂肪的含量及氨態(tài)氮/總氮比值降低，桑發(fā)酵品質(zhì)得到改善。