不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔免疫生理的影響

譚劍蓉， 干友民， 宋中齊， 石海橋， 江 紅， 沈玲玲

（1.豐都縣畜牧技術(shù)推廣站，重慶豐都 408200；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川溫江 611130；3.河南廣安生物科技股份有限公司，河南鄭州 450000）

隨著我國畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，飼料資源短缺問題日益嚴(yán)重。傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)以谷物和動(dòng)植物蛋白質(zhì)來配制日糧，飼料用糧占糧食產(chǎn)量的比重不斷增長，導(dǎo)致人畜同糧人畜爭糧的矛盾日益突出。為此，國務(wù)院倡導(dǎo)改變農(nóng)業(yè)二元為三元耕作制度，加大飼料作物和優(yōu)質(zhì)牧草的生產(chǎn)力度，鼓勵(lì)發(fā)展不與人類爭奪糧食的草食家畜養(yǎng)殖，以滿足我國畜牧業(yè)對(duì)飼料和牧草日益增長的需求 （王憑青等，2001）。開辟質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的牧草飼料原料，降低飼養(yǎng)成本，生產(chǎn)綠色畜產(chǎn)品，成為畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題。白三葉（Trifolium repens L）是世界上分布最廣的一種豆科牧草，初花期干物質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)24.7%，纖維含量相對(duì)低于禾本科，礦物含量高于禾本科，富含氨基酸和多種維生素（維生B、C、E和K），具有高度易消化性、營養(yǎng)性及適口性（董寬虎和沈益新，2003）。

目前國內(nèi)外對(duì)白三葉牧草的利用主要為放牧、刈割青飼、青貯、干草，并以白三葉與禾本科混合飼喂反芻家畜的研究較多。但對(duì)白三葉草粉添加到動(dòng)物日糧尤其是肉兔日糧的深入研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)旨在研究不同比例的白三葉草粉對(duì)肉兔免疫生理的影響，初探其作用機(jī)理，以獲得白三葉草粉在肉兔日糧中的適宜比例，為生產(chǎn)實(shí)踐和推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選用（30±2）日齡、健康狀況良好、體重[（650±30）g]相近、公母各半的 150只斷奶新西蘭兔。采用5處理5重復(fù)單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法，設(shè)計(jì)5個(gè)試驗(yàn)組，其中1個(gè)對(duì)照組，4個(gè)處理組，每個(gè)試驗(yàn)組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只兔子。白三葉草粉在日糧中的比例分別為0%（對(duì)照組）、10%（處理Ⅰ組）、20%（處理Ⅱ組）、30%（處理Ⅲ組）和40%（處理Ⅳ組）。

本試驗(yàn)所用白三葉品種為“海法”，由四川省雅安市寶興縣蜂桶寨鄉(xiāng)提供，盛花期刈割，經(jīng)快速自然干燥后加工成草粉，其營養(yǎng)成分（風(fēng)干樣）為：粗蛋白質(zhì)19.63%，粗脂肪2.01%，粗纖維24.71%，中性洗滌纖維46.06%，酸性洗滌纖維41.4%，鈣0.15%，總磷 0.22%，賴氨酸0.79%，含硫氨基酸0.33%。參照中華人民共和國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法測定營養(yǎng)成分，參照 NRC（1977）《兔的營養(yǎng)需要量》標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)各試驗(yàn)組飼料配方，配制成直徑為5 mm的顆粒飼料。各試驗(yàn)組的飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 不同處理組飼料配方及營養(yǎng)成分

1.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)于2012年7月4日～8月9日在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所農(nóng)場基地進(jìn)行。預(yù)飼7 d，預(yù)試期內(nèi)進(jìn)行分組，驅(qū)蟲和免疫注射。正飼30 d，其中1～15 d為試驗(yàn)前期，15～30 d為試驗(yàn)后期。每天分別于 8：00、12：00和 18：00人工喂料，自由采食和飲水，定期對(duì)飼槽和兔舍進(jìn)行消毒，所有試兔均在同一兔舍內(nèi)籠養(yǎng)，各試驗(yàn)組肉兔均處于相同的管理和衛(wèi)生條件。每天清掃兔舍，每7 d噴霧消毒兔舍內(nèi)外，保持通風(fēng)換氣。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 免疫器官指標(biāo) 于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)抽取10只共50只肉兔停水2～4 h，停食12 h后進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。宰前稱重記錄為宰前活重，屠宰后記錄肝臟重和脾臟重，分別計(jì)算肝臟和脾臟與宰前活重的比值。

肝臟指數(shù)/%=肝臟重/宰前活重×100%；脾臟指數(shù)/%=脾臟重/宰前活重×100%。

1.3.2 血液生化指標(biāo)、免疫指標(biāo) 于試驗(yàn)結(jié)束后屠宰前每組隨機(jī)抽取15只肉兔心臟采血，3500 r/min離心20 min后分離血清，液氮速凍，-80℃冰箱保存，用于測定血清中以下指標(biāo)：

血液生化指標(biāo)：堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白 （ALB）、總膽固醇 （T-CHO）、甘油三酯（TG）。冷凍血清在室溫下解凍后，用AUTOLAB全自動(dòng)生化分析儀分析各項(xiàng)指標(biāo)。

血液免疫指標(biāo)：免疫球蛋白含量（IgG、IgA、IgM）用免疫比濁法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以重復(fù)為統(tǒng)計(jì)單位，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，均采用SAS（Ver.8.2）2軟件中最小變異二乘檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔免疫器官的影響 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔免疫器官的影響見表2。由表2可以看出，各組間肝臟指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但各處理組肝臟指數(shù)均低于對(duì)照組。各組間脾臟指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但各處理組脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組。

2.2 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響 白三葉草粉對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響見表3。由表3可知，各組間堿性磷酸酶活性、總膽固醇和甘油三酯水平差異不顯著（P＞0.05）。處理II組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著高于處理I組35.66%（P＜0.01），顯著高于對(duì)照組23.91%（P＜0.05）。處理III組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著高于處理II組26.47%（P＜0.01）。處理II、IV組尿素氮水平顯著高于處理 I組 7.99%、14.04%（P＜0.05）。處理IV組γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性極顯著高于處理I組27.34%（P＜0.01），顯著高于處理II組21.11%（P＜0.05）。處理III、IV組血糖水平顯著高于對(duì)照組90.61%、75.12% （P＜0.05）。處理IV組總蛋白水平極顯著高于處理III組16.26%（P＜0.01），顯著高于處理I組7.84%和對(duì)照組9.46%（P＜0.05）。處理III組白蛋白水平極顯著高于對(duì)照組26.96%（P＜0.01），顯著高于處理I組23.79%和II組21.56%（P＜0.05）。

表2 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔免疫器官的影響

表3 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響

2.3 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔血液免疫指標(biāo)的影響 白三葉草粉對(duì)肉兔血液免疫指標(biāo)的影響見表4。由表4可知，處理IV組IgG水平最高，為9.09 mg/mL，極顯著高于處理I組108.49%、II組53.29%、III組 109.45%（P ＜0.01）。 各處理組 IgM水平均高于對(duì)照組，其中以處理IV組最高，為1.38 mg/mL，顯著高于對(duì)照組 272.97%（P＜0.05）。除了處理II組的IgA水平略低于對(duì)照組以外，其余各處理組IgA水平均高于對(duì)照組，其中以處理IV組最高為0.84 mg/mL，極顯著高于對(duì)照組366.67%和處理 II組460.00%（P＜0.01），顯著高于處理I組250.00%、III組189.66%（P＜0.05）。

表4 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔血液免疫指標(biāo)的影響mg/mL

3 討論

3.1 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔免疫器官的影響 添加白三葉草粉的處理組肝重均低于對(duì)照組，各處理組間以及處理組與對(duì)照組間肝臟指數(shù)差異不顯著 （P＞0.05）。添加白三葉草粉組的脾臟重均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），各處理組間以及處理組與對(duì)照組間脾臟指數(shù)差異不顯著 （P＞0.05）。肝臟既是重要的消化器官，也是重要的解毒器官。陳宏權(quán)等（1998）研究發(fā)現(xiàn)，纖維具有增加肝臟重量的作用。Pond等（1988）對(duì)肥育豬苜蓿草粉日糧的研究表明，健康正常豬的肝臟、心臟、胃和腸的相對(duì)重量較大。通常免疫器官重量的增加表示免疫能力的增強(qiáng)，免疫器官指數(shù)越大表明動(dòng)物的免疫能力越強(qiáng)。晁洪雨和李福昌（2007）研究表明，隨日糧ADF水平的提高，肝臟指數(shù)逐漸下降（P＜0.05）。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也表明，隨白三葉草粉比例的增加，ADF水平逐漸提高，試驗(yàn)組的肝重及肝臟指數(shù)也呈下降趨勢。脾臟是機(jī)體免疫的第三道防線，脾臟指數(shù)在一定程度上能夠反映機(jī)體的免疫功能，健康范圍內(nèi)免疫指數(shù)越大表明免疫功能就越強(qiáng)（劉太宇等，2009）。陶志勇和李福昌（2005）研究表明，肉兔脾臟重和脾臟指數(shù)隨日糧NDF水平的提高呈增加的趨勢，認(rèn)為斷奶至2月齡肉兔NDF水平以30%～33%為宜。晁洪雨和李福昌（2007）研究表明，脾臟重和脾臟指數(shù)隨日糧ADF水平的提高呈遞增趨勢，建議斷奶至2月齡肉兔ADF水平為19%。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，隨白三葉草粉比例的增加，NDF和ADF水平提高，以NDF水平25.36%～27.71%，ADF水平19.56%～22.32%為宜。

3.2 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔血液生化指標(biāo)的影響 酶是機(jī)體新陳代謝的催化劑，機(jī)體代謝反應(yīng)系列活動(dòng)的速率受到酶活性的影響。血清中的堿性磷酸酶（ALP或AKP）主要來自于肝臟和骨骼，通過催化水解磷酸單酯而將底物分子的磷酸基因去除，生成磷酸根離子和自由羥基，是一種能夠?qū)⒌孜铮òê怂?、蛋白、生物堿等）去磷酸化的酶，與骨骼的代謝密切相關(guān)。Yablanski（1986）認(rèn)為血漿中的AKP活性與長白豬的平均日增重呈正相關(guān)。吳信生等（2001）研究表明，血漿AKP活性與家兔平均日增重呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），血漿AKP活性在一定程度上能夠反映肉兔的生長速度。本試驗(yàn)中除了處理II組以外，ALP活性隨白三葉草粉添加量的增加呈上升的趨勢，并且與平均日增重的變化趨勢一致，與前兩者的研究結(jié)果一致，說明適宜添加量的白三葉草粉有利于肉兔的生長發(fā)育。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是機(jī)體內(nèi)分布最廣、活力最強(qiáng)的兩種酶，其活力不僅可以反映肝臟的功能，還可以反映體內(nèi)蛋白的代謝情況。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，肉兔谷草轉(zhuǎn)氨酶隨白三葉草粉添加量的變化趨勢與平均日增重變化趨勢基本一致，說明該酶活性與日增重有一定的相關(guān)性。各處理組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨白三葉草粉添加量的增加呈整體上升的趨勢。機(jī)體γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶主要來自肝臟，其活性能反映肝功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各處理組γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性隨白三葉草粉添加量的增加呈上升的趨勢，表明適宜量的白三葉草粉有利于肝臟活動(dòng)，這可能與白三葉草中的活性成分有關(guān)（譚劍蓉等，2012），其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

血清總蛋白是白蛋白和球蛋白之和，白蛋白由肝臟合成，除了作為營養(yǎng)物質(zhì)的載體、維持血漿滲透壓外，還可以修復(fù)組織和提供能量。球蛋白是由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的漿細(xì)胞分泌，除了具有白蛋白的功能外，還是機(jī)體的抗體，具有保護(hù)機(jī)體和反映抵抗力的重要作用 （劉太宇等，2009）。Luzi和Maertens（1998）研究表明，肝細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)會(huì)降低血漿中總蛋白和白蛋白的含量。本研究結(jié)果顯示，白蛋白含量隨白三葉草粉添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，說明適宜量的白三葉草粉對(duì)肉兔是有利的?？偟鞍缀侩S白三葉草粉添加量的增加呈上升的趨勢，但30%草粉組卻不在此變化趨勢范圍，該組白蛋白含量高于其他試驗(yàn)組，而總蛋白的降低是由球蛋白降低所引起。

日糧纖維能夠增強(qiáng)腸道食糜的黏性，使得小腸的不攬水層（流動(dòng)狀凝膠膜）加厚，而抑制葡萄糖向腸壁的擴(kuò)散，使血糖濃度降低 （歐仕益等，1998）。 Ellis等（1995）認(rèn)為，日糧纖維可能通過影響某些激素水平來影響血糖濃度。楊玉芬等（2003）研究表明，一定含量的日糧纖維具有降低機(jī)體血糖的作用。本研究結(jié)果表明，隨白三葉草粉添加量的增加，肉兔血糖濃度呈先升高后降低的趨勢，說明當(dāng)日糧纖維達(dá)到適宜水平時(shí)，能夠降低血糖濃度。

血清中尿素氮和總蛋白是反映蛋白代謝的兩項(xiàng)重要指標(biāo)，尤其是尿素氮更能直接的反映蛋白在機(jī)體內(nèi)的吸收利用情況。尿素氮是機(jī)體內(nèi)蛋白、氨基酸代謝的最終產(chǎn)物，其濃度受到飼料中蛋白、氨基酸質(zhì)和量的影響，尿素氮濃度的降低，表明蛋白的合成作用增強(qiáng)，氮沉積增強(qiáng)，其濃度與機(jī)體內(nèi)氮沉積率、蛋白和氨基酸的利用率呈負(fù)相關(guān)（Malmlo，1988）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，血清中尿素氮的濃度隨白三葉草粉量的增加呈上升趨勢，表明一定比例的白三葉草粉有利于機(jī)體蛋白和氨基酸的利用。

本研究結(jié)果顯示，隨白三葉草粉量的增加，總膽固醇變化趨勢不明顯，但以處理I組和處理III組最低，甘油三酯差異不顯著，以處理I組最低，說明適宜量的白三葉草粉有降低脂類的作用。國內(nèi)外大量的試驗(yàn)表明，苜蓿皂苷能降低血清膽固醇的含量和腸道對(duì)膽固醇的吸收，增加內(nèi)源和外源型中性固醇和膽酸的排泄，降低石膽酸和脫氧膽酸的排泄（Malinow 等， 1980、1978、1977）。由于白三葉屬于豆科牧草，含有豆科牧草中一般存在的皂苷物質(zhì)（Tan等，2012），很有可能引起膽固醇和甘油三酯的以上變化。

3.3 不同比例白三葉草粉對(duì)肉兔血液免疫指標(biāo)的影響 免疫球蛋白是機(jī)體受到抗原刺激后產(chǎn)生的，能與抗原特異性作用。IgG是血清中重要的抗體，約占血清總免疫球蛋白的75%，能夠抗菌和抗病毒，并且能中和毒素而使其失去毒性，還能夠起凝集和沉淀抗原作用。IgM是機(jī)體內(nèi)最先產(chǎn)生的抗體，在機(jī)體抗感染早期起非常重要的作用，當(dāng)機(jī)體受病原感染后與補(bǔ)體結(jié)合而溶解病原體，還具有抗毒素、抗病菌和抗腫瘤等作用（高鳳山等，2006）。IgA除了具有抗病菌和抗病毒作用以外，對(duì)呼吸道和消化道等局部黏膜還起免疫屏障作用（于船，1987）。 Dawkins 等（2003）研究表明，機(jī)體免疫系統(tǒng)受內(nèi)外環(huán)境的雙重影響，并且始終處于動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)過程中。本研究結(jié)果表明，處理組的血清IgM含量均高于對(duì)照組，IgM、IgA和IgG三項(xiàng)指標(biāo)均以40%草粉組最高。說明適宜比例的白三葉草能夠增強(qiáng)肉兔的免疫功能，這可能與白三葉草中的活性物質(zhì)能夠增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能有關(guān)，但其作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加適宜比例的白三葉草粉對(duì)肉兔免疫生理是有利的，并且在本試驗(yàn)條件下，以添加40%三葉草粉的飼養(yǎng)效果最好。