硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對(duì)牛體重及免疫功能的影響

王洪發(fā) ， 包海鷹 ， 張 亮

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林郭爾羅斯生物飼料有限公司，吉林松原138000）

隨著人們生活水平的逐漸提高，人們對(duì)肉的品質(zhì)追求也越來(lái)越高。然而，抗生素殘留等問(wèn)題，讓人們意識(shí)到傳統(tǒng)抗生素型飼料添加劑正不斷危害著人類(lèi)身體健康，加上各國(guó)逐漸開(kāi)始限制抗生素的使用，增加了綠色型飼料添加劑開(kāi)發(fā)的必要性。復(fù)方飼料添加劑是代替抗生素型添加劑的選擇之一，一方面其原材料生長(zhǎng)于自然，開(kāi)發(fā)資源廣闊（劉瀾，2014），無(wú)污染、機(jī)體殘留極少、不易產(chǎn)生抗藥性（張亮，2017），對(duì)于改善動(dòng)物腸道環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫以及改良動(dòng)物制品質(zhì)量都有顯著的影響（Mendel，2017；Jouany，2007）。 另一方面，由于人們對(duì)牛肉的品質(zhì)和需求量不斷提高 （趙成堅(jiān)，2016），如何提高牛肉產(chǎn)量，提供優(yōu)質(zhì)的牛肉（馮來(lái)順，2018），同時(shí)也提高牧民經(jīng)濟(jì)成為首要解決的問(wèn)題。本文以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，以硬毛粗蓋孔菌固體發(fā)酵物為主藥配制復(fù)方飼料添加劑，研究其對(duì)牛的生長(zhǎng)發(fā)育、血液生化指標(biāo)及免疫功能的影響，旨在為硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑在牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物由吉林郭爾羅斯生物飼料有限公司提供，為健康的12月齡、生長(zhǎng)發(fā)育良好、體重在480 kg左右的西門(mén)塔爾公牛20頭。

1.2 試驗(yàn)材料 硬毛粗蓋孔菌固體發(fā)酵物由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菌物資源及開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)研究室發(fā)酵獲得；黃芪、甘草均采購(gòu)于長(zhǎng)春市宏檢大藥房。

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；無(wú)菌超凈工作臺(tái)（新加坡藝思高科技有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；生化培養(yǎng)箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；80-2臺(tái)式離心機(jī)（天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠）；電冰箱（青島海爾股份有限公司）；地磅；血液生化分析儀（希森美康醫(yī)用電子有限公司）

1.4 日糧配方及成本 精料按照我國(guó)牲畜飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，選用本地常規(guī)的原料進(jìn)行配制，精料具體配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 日糧精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 硬毛粗蓋孔菌的固體發(fā)酵 菌種鑒定：取干凈硬毛粗蓋孔菌子實(shí)體，75%酒精擦拭表面，在無(wú)菌操作臺(tái)中紫外滅菌30 min，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，以ITS1和ITS4為引物，PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物以Marker上樣，20 min后停止電泳，有白亮色條帶。后送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)，利用GenBank BLAST進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果其 DNA序列與 F.trogii（Berk.）Bondartsev&Singer的相似度達(dá)到99%，確定為硬毛粗蓋孔菌子實(shí)體。

菌種擴(kuò)繁：采用上述方法取硬毛粗蓋孔菌子實(shí)體，接種在GPY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿白色菌絲。在培養(yǎng)皿中用直徑1 cm的打孔器取下一小塊接種在液體培養(yǎng)基中液體搖床培養(yǎng)7 d后，長(zhǎng)滿大小不同的白色菌球。

固體發(fā)酵：選用廢棄的秸稈和楊樹(shù)枝（1：1），料液比（2：5），滅菌后將上述培養(yǎng)的白色菌球接種到菌袋中，進(jìn)行硬毛粗蓋孔菌的固體發(fā)酵，經(jīng)28 d左右可獲得硬毛粗蓋孔菌固體發(fā)酵物，曬干備用。

1.5.2 藥材處理 制備：將干燥后的固體發(fā)酵物、甘草、黃芪分別用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)4 mm篩，備用。拌料：取干燥的發(fā)酵物粉末，將甘草與黃芪按比例攪拌，混勻。出料：將拌好的原材料置于55℃烘干。用紫外線照射殺菌，裝袋，抽氣封口。置于干燥低溫，避光保存。

1.5.3 試驗(yàn)前處理 試驗(yàn)前對(duì)牛、圈舍、場(chǎng)地進(jìn)行全面的消毒。采用圈舍飼養(yǎng)，自由飲水，早晚2次（6：0和16：00）飼喂。每頭牛按照2.5 kg的精料飼喂，預(yù)飼期3 d，試驗(yàn)期30 d。

1.5.4 稱(chēng)重及血液的采集 A組為空白組，B、C、D組分別按照精料量的1%、3%、5%進(jìn)行飼喂。在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)于晨飼前對(duì)所有試驗(yàn)牛進(jìn)行空腹稱(chēng)重，詳細(xì)記錄體重。所有試驗(yàn)牛的平均末重減掉平均初重，即為平均增重，再除以30 d即為平均日增重。在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日，用一次性采血管于頸靜脈進(jìn)行采血，血液樣品離心后，采用血液生化分析儀進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定并用試劑盒進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graph-Pad Prism 5進(jìn)行制圖，用SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析處理，采用LDS法進(jìn)行組間的顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 西門(mén)塔爾公牛體重 由表2可知，各組牛平均初重差異不顯著（P＞0.05）；經(jīng)過(guò)30 d的試驗(yàn)，在平均末重中C組較A組、B組和D組分別提高1.97%、1.24%和0.78%（P＜0.05），而A組、B組和D 組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 B、C、D 組平均增重分別比A組提高20.1%、52.97%和29.4%（P＜0.01）， 且 B、C、D三組之間差異極顯著 （P＜0.01）。由此可見(jiàn)，精料中添加硬毛粗蓋孔菌添加劑能顯著增加牛的體重，以3%的添加比例增重效果最明顯。

2.2 血液生化指標(biāo)分析 由表3可知，B、C、D組的尿素 （UREA）含量分別較A組降低10.39%、11.35%和10.96%（P＜0.05），但三個(gè)組之間無(wú)明顯差異。膽固醇 （TCHE）中C、D組較A組降低6.63%和 6.31%（P ＜ 0.05），B 組與 A、C、D 組均無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），C組低于D組，D組低于B組。血糖（GLUC）中，與A組相比，C、D組分別升高了 8.39%和 7.04%（P ＜ 0.05），B 組與 A、C、D組均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。C組高于D組，D組高于B組。甘油三酯（TG）指標(biāo)中，C組較A組降低了18.6%（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著性差異（P ＞ 0.05）。 總蛋白（TP）中，與 A 組相比，D 組升高了 5.35%（P＜0.05），B、C 組均有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 免疫參數(shù)分析 由圖1可知，IgA、IL-2、IL-4三個(gè)免疫指標(biāo)中，C組較A組分別提高了27.99%、39.02%和37.63%（P＜0.05），但與其他組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），A組與B、D兩組間的差異不顯著（P＞0.05），B組與D組差異也不顯著 （P＞0.05）。C、D兩組 IgG較 A組分別提高了 21.06%和15.64%（P＜0.01），C組較B組提高了 11.42%（P＜0.05），而C組與D組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與A組相比，除D組IFN-γ提高了15.58% （P＜0.05）外，B 組、C 組均無(wú)顯著差異（P ＞ 0.05），B、C、D三個(gè)組之間也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對(duì)牛體重的影響眾所周知，抗生素的弊病已日益明顯，動(dòng)物食品中藥物殘留和耐藥性等問(wèn)題嚴(yán)重影響到食品安全和公共衛(wèi)生安全（張中橋，2018），急需一種新的抗生素替代品。而菌物類(lèi)飼料添加劑具有純天然性、多功能性、來(lái)源廣泛、有害殘留少、毒副作用小、幾乎對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染和具有防霉防腐敗作用等優(yōu)點(diǎn)，并且能全面調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能，在復(fù)方飼料添加劑領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力（李玉娟，2015）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂3%硬毛粗蓋孔菌復(fù)方飼料添加劑的試驗(yàn)牛平均增重和平均日增重分別達(dá)到了43.08 kg，1435.87 g/d。日增重比空白組增長(zhǎng)了52.97%，飼料轉(zhuǎn)化率比空白組提高了34.59%。可能一方面是由于甘草具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，調(diào)和諸藥之功（郭爭(zhēng)爭(zhēng)，2015）；黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用（尚麗君，2019）。另一方面是硬毛粗蓋孔菌能夠改善動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能，對(duì)纖維素具有良好的降解能力，刺激牛、羊等反芻動(dòng)物的胃腸，幫助消化吸收，從而提高牛的體重。

3.2 硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對(duì)牛血液生化指標(biāo)的影響 血清生化指標(biāo)不僅能夠反映機(jī)體健康與否和生長(zhǎng)速度快慢，更能有效的檢測(cè)出機(jī)體免疫因子和新陳代謝是否正常（姜賀，2015）。本試驗(yàn)中，血糖及總蛋白的含量和空白組相比都有較大的升高趨勢(shì)，而尿素、膽固醇和甘油三酯則是降低趨勢(shì)。這說(shuō)明了該添加劑使機(jī)體合成代謝得到加強(qiáng)，可為動(dòng)物提供充足的能量，增強(qiáng)免疫力，使其健壯的生長(zhǎng)。同時(shí)降低膽固醇和甘油三酯，表明復(fù)方添加劑可以改善肝功能，機(jī)體中脂類(lèi)合成處于平衡狀態(tài)，降低了肝臟疾病的發(fā)生。

3.3 硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對(duì)牛免疫指標(biāo)的影響 細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞或某些非免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激誘導(dǎo)合成和分泌的一類(lèi)有生物活性的小分子多肽。細(xì)胞因子可參與免疫細(xì)胞的分化發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、刺激造血以及促進(jìn)組織修復(fù)等（孟祥樂(lè)，2017；魏靜，2016）。本試驗(yàn)中與空白組相比：B 組 IgA、IgG、IFN-γ、IL-2、IL-4的含量均有升高，但差異不顯著（P＞0.05）。C組IgA、IL-2、IL-4 的含量顯著升高 （P ＜ 0.05），IgG的含量則極顯著升高（P＜0.01），而IFN-γ的含量沒(méi)有顯著性差異（P ＞ 0.05）。D 組 IgA、IL-2、IL-4的含量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但I(xiàn)FN-γ、IgG的含量分別為顯著性（P＜0.05）和極顯著性（P＜0.01）升高。從上述可知，硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑可以提高肉牛的免疫球蛋白、干擾素以及白介素的含量，其機(jī)制可能是菌物與中草藥之間相互配伍，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，分泌免疫活性物質(zhì)，使其增殖分化，從而提高肉牛的免疫功能。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑組牛的體重及免疫功能均有增高的趨勢(shì)，尤其是3%劑量組效果顯著，不僅可以降低尿素和膽固醇以及甘油三酯的含量，而且還能使I-gA、IgG、IL-2、IL-4的含量顯著增高。 因此，在使用該飼料添加劑時(shí)比例不宜過(guò)高，添加量應(yīng)控制在3%左右為宜。