紫外鏈霉素復(fù)合誘變選育高產(chǎn)surfactin菌株研究

莫怡琴，劉 杰，劉 蕓，胡美忠

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁 554300）

Surfactin是芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)生的一種抗菌脂肽，化學(xué)結(jié)構(gòu)為7個(gè)氨基酸殘基寡肽與13～15個(gè)碳的β羥基脂肪酸縮合成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（田秋月等，2019）。Surfactin具有許多優(yōu)良的性能，如抗菌活性，能抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌，且與抗生素具有不同的作用機(jī)制；抗病毒活性，對皰疹病毒、包膜病毒等病毒具有抑制活性 （Kracht等，1999；Kameda 等，1974）；抗腫瘤活性，能控制人類結(jié)腸癌細(xì)胞株的繁殖（Kim等，2007）。Surfactin的優(yōu)良性能使其在畜牧養(yǎng)殖、醫(yī)藥、食品、化工等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

大量研究發(fā)現(xiàn)，surfactin在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中具有替代抗生素的潛力，胡美忠等（2018）雛雞養(yǎng)殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，surfactin在日增重和死亡率及血液生化指標(biāo)方面優(yōu)于金霉素，翟少偉等（2016）研究指出，飼料中添加surfactin可以提高中華鱉稚鱉的生長性能和腸道消化酶活性。然而自然界野生芽孢桿菌菌株產(chǎn)surfactin產(chǎn)量極低，本實(shí)驗(yàn)室篩選的一株產(chǎn)surfactin的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis S21，其初始產(chǎn)量約為0.02～0.03 mg/mL，極低的產(chǎn)量制約了surfactin的進(jìn)一步研究及應(yīng)用，為獲得高產(chǎn)surfactin菌株，本試驗(yàn)以B.subtilis S21為出發(fā)菌株，采用紫外和鏈霉素復(fù)合誘變選育高產(chǎn)surfactin菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 試驗(yàn)菌株：B.subtilis，銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心中獸藥微生物發(fā)酵研究室篩選鑒定，并專利保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號CGMCC No：15544。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品，sigma公司生產(chǎn)，純度為98%；鏈霉素，華北制藥生產(chǎn)，純度為98%；無菌脫纖維羊血，鴻泉生物生產(chǎn)；其他試劑，市售，分析純。

ZHJH-C1214C型超凈工作臺，上海智城；1100型液相色譜儀，安捷倫；HVE-50型高壓滅菌鍋，北方華粵；DELTA 320型pH計(jì)，上海閔勝；BPH-9042型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0～7.2。

pH 7.8無菌磷酸緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59 g與磷酸二氫鉀0.41 g，加蒸餾水定容至1000 mL，過濾，121 ℃滅菌 20 min。

LiCl的配制：準(zhǔn)確稱取3 g LiCl固體于10 mL容量瓶中，先加入6 mL pH 7.8的磷酸緩沖液溶解后，定容至10 mL，配制成濃度30%的母液，4℃保藏，臨用前用0.45μm無菌濾膜過濾。

鏈霉素母液的配制：準(zhǔn)確稱取0.5 g鏈霉素粉末置于10 mL容量瓶中，先加入6 mL pH 7.8的磷酸緩沖液溶解后，定容至10 mL，配制成50000 mg/L的溶液，再稀釋至50 mg/L得母液，4℃保藏，臨用前用0.45μm無菌濾膜過濾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 -70℃保藏的B.subtilis S21，-4℃解凍后，將B.subtilis S21轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，接種環(huán)挑取某一單菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h，備用。

1.2.2 紫外誘變 分別吸取活化的B.subtilis S21 2 mL，置于6個(gè)無菌培養(yǎng)皿，輕輕搖勻，黑暗條件下離紫外燈12 cm下分別照射0（對照組）、60、120、180、240、300 s。 照射后的菌液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋至1010倍后，取100μL稀釋液涂平板，編號分別為 0、1、2、3、4、5。37 ℃避光倒置培養(yǎng)36 h，選取致死率為80%～90%的平板單個(gè)菌落，用無菌牙簽挑至LB固體培養(yǎng)基上。37℃避光倒置培養(yǎng)24 h后，菌落再轉(zhuǎn)接至血瓊脂平板上（滅菌后的LB固體培養(yǎng)基冷卻到60℃左右時(shí)加入10%無菌脫纖維羊血混勻倒平板，下同），在37℃倒置培養(yǎng)72 h，用游標(biāo)卡尺測溶血圈大小和菌體大小。

1.2.3 鏈霉素誘變 經(jīng)紫外誘變選育，得到二株效果較佳的菌株，編號為19、27。19、27號菌株分別按1.2.1方式活化后，取1 mL菌液和1 mL 30%氯化鋰在2 mL離心管中混勻（氯化鋰作為協(xié)同誘變劑），在37℃下保溫30 min后，吸取1 mL混合液，稀釋104倍，取1 mL稀釋液和1mL生理鹽水加入到23 mL LB固體培養(yǎng)基中混勻倒平板（對照組）；另取1 mL稀釋液和1 mL 50 mg/L鏈霉素溶液加入到23 mL LB固體培養(yǎng)基中混勻倒平板（鏈霉素濃度根據(jù)前期致死率試驗(yàn)確定，此濃度菌株的致死率約為80%～90%）。37℃倒置培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基。37℃倒置培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)接至血瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)72 h，用游標(biāo)卡尺測溶血圈大小和菌體大小。

1.2.4 HPLC復(fù)檢 Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積關(guān)系的方程制作：精密配制surfactin（sigma）標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，采用安捷倫1100型色譜儀檢測其峰面積與濃度的關(guān)系，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。液相色譜條件：色譜柱，安捷倫5 TC-C18，檢測波長為210 nm，流速1 mL/min，時(shí)間0～20 min，90%乙腈-90%乙腈（有機(jī)相和水相均含0.1%三氟乙酸）。

經(jīng)過紫外、鏈霉素誘變后，得到溶血圈大小/菌體大小比值比較大的菌12株，分別接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，將菌液在80℃烘箱中烘干，用25 mL甲醇溶解，10000 r/min離心10 min，過濾后，同標(biāo)準(zhǔn)曲線方程色譜條件，液相測定surfactin的峰面積，通過峰面積計(jì)算出surfactin含量。

1.2.5 穩(wěn)定性檢測 篩選出效果最好的菌株，傳代8代后，通過液相檢測其surfactin含量。

2 結(jié)果分析

2.1 紫外誘變 從B.subtilis S21出發(fā)，挑取了33個(gè)誘變菌落，其溶血圈直徑/菌落直徑見表1。

從表1可看出，對照組菌株溶血圈直徑/菌落為1.09，其余突變體的溶血圈直徑/菌落直徑比值不一，但均比對照組高，說明選取的菌落均發(fā)生了正突變。96號處理溶血圈直徑/菌落直徑比值為1.3，相對于對照，增加最少，只增加19.27%，27號處理溶血圈直徑/菌落比值為2.61，19號處理溶血圈直徑/菌落直徑為2.51，相對于對照分別增加了139.45%、130.3%。

表1 B.subtilis S21紫外線誘變后溶血圈及菌體

Surfactin會(huì)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，其溶血性能與其濃度呈正相關(guān)，故可根據(jù)surfactin產(chǎn)生溶血的原理來初步選育高產(chǎn)surfactin菌株，高產(chǎn)surfactin菌株，其溶血圈直徑/菌落直徑會(huì)越大（郅巖，2017；李媛，2009）。

2.2 鏈霉素誘變

2.2.1 氯化鋰和鏈霉素對B.subtilis S21-19的復(fù)合誘變 從B.subtilis S21-19出發(fā)，挑取了38個(gè)誘變菌落，其溶血圈直徑/菌落直徑見表2。

表2 B.subtilis S21-19氯化鋰和鏈霉素誘變處理后溶血圈及菌體

從表2可以看出，對照組菌株溶血圈直徑/菌落直徑為3（不同試驗(yàn)批次，因?yàn)槠桨宓暮穸燃芭囵B(yǎng)時(shí)間等有不同，其菌株溶血圈直徑/菌落直徑會(huì)有變化，下同），其余突變體的溶血圈直徑/菌落直徑比值不一，但比值均較對照組下降，只有7號處理、4號處理有提高，說明選取的菌落經(jīng)過氯化鋰和鏈霉素復(fù)合誘變后多數(shù)發(fā)生了負(fù)突變，少數(shù)發(fā)生正突變。38號處理溶血圈直徑/菌落直徑比值為1.44，相對于對照組，減少最為嚴(yán)重，減少52%，7號處理溶血圈直徑/菌落比值為3.68，增加最多，為22.67%，4號處理溶血圈直徑/菌落直徑為3.45，增加15%。

2.2.2 氯化鋰和鏈霉素對B.subtilis S21-27的復(fù)合誘變 從B.subtilis S21-27出發(fā)，挑取了38個(gè)誘變菌落，其溶血圈直徑/菌落直徑見表3。

表3 B.subtilis S21-27氯化鋰和鏈霉素誘變?nèi)苎熬w

從表3可以看出，對照菌株溶血圈直徑/菌落為1.42，其余突變體的溶血圈直徑/菌落直徑比值不一，但比值均比對照組有提高。4`號處理溶血圈直徑/菌落直徑比值為 4.34，增加最多，為205.63%；1`號處理溶血圈直徑/菌落直徑比值為4.22次之，為197.18%。

2.2.3 HPLC復(fù)測 液相色譜獲得surfactin峰面積與濃度 （mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=6920.7x+404.36，R2=0.9976 （y為峰面積，x 為濃度）（田秋月等，2019）。

液相檢測溶血圈/菌體結(jié)果較好的菌株11株，surfactin的含量結(jié)果見表4。從表可以看出，溶血圈/菌體比值與液相檢測結(jié)果趨勢一致，證實(shí)可以用此方法進(jìn)行初篩，然后根據(jù)初篩結(jié)果，再用液相進(jìn)行復(fù)測，最終得到篩選結(jié)果良好的菌株。

表4 HPLC檢測篩選菌株發(fā)酵液surfactin含量

2.3 穩(wěn)定性檢測 選取誘變后比初始菌株產(chǎn)量增加 800%以上的菌株 5 株 （1`、4`、5`、38`、50`）檢測發(fā)酵液中surfactin含量，發(fā)現(xiàn)只有38`保持穩(wěn)定，傳代8代，每代測其發(fā)酵液中surfactin含量為0.28～0.35 mg/mL，其第8代發(fā)酵液surfactin含量為0.28 mg/mL，比原始菌株S21增加了9.33倍。其余4株菌surfactin含量波動(dòng)較大，傳代至第7代后，surfactin含量在0.1 mg/mL以內(nèi)。

3 結(jié)論

Surfactin是一種極為優(yōu)良、可替代抗生素在畜牧業(yè)中使用的抗菌脂肽，但是極低的產(chǎn)量制約了surfactin的開發(fā)利用，因此提升surfactin產(chǎn)量是大規(guī)模開發(fā)利用surfactin的前提。誘變是提升代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的一種常用方法，具有經(jīng)濟(jì)時(shí)效優(yōu)點(diǎn)，常用來進(jìn)行誘變育種，以獲得高產(chǎn)種（龔定芳等，2019）。

本試驗(yàn)通過紫外和鏈霉素復(fù)合誘變，使其產(chǎn)量從最初的0.03 mg/mL提升到0.34 mg/mL（38'菌株），且經(jīng)過8代傳代培養(yǎng)后，其產(chǎn)量還穩(wěn)定在0.28 mg/mL，證明38'菌株遺傳穩(wěn)定性較佳，下一步可采用此菌株進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，進(jìn)一步提升surfactin產(chǎn)量。