利用紫外線輻射技術修復抗性基因污染土壤

吳叢楊慧 高連東

摘 要：針對來自醫(yī)療廢物堆放場地的抗性基因污染土壤，本研究利用紫外線輻射技術進行土壤修復。其間通過試驗研究了紫外波長與照射時間、土壤中碳酸鈣含量對土壤中關注類抗性基因氨基糖苷類（aminoglycosides）、氯霉素類（chloramphenicol）、磺胺類（sulfonamides）、四環(huán)素類（tetracycline）的降解影響。結果表明，在254 nm紫外波長的照射下，向土壤添加5%的石灰，設置1 min的紫外照射時間，更有利于上述四種抗性基因的降解，可有效修復該污染土壤。

關鍵詞：土壤修復;抗生素抗性基因;高通量測序;降解

中圖分類號：TU991.25文獻標識碼：A文章編號：1003-5168（2020）35-0137-04

Abstract： In this study， ultraviolet radiation technology was used to dispose the soil samples from the medical waste dump site. During the experiment， the effects of ultraviolet wavelength， irradiation time， and calcium carbonate content in the soil on the degradation of resistance genes of concern namely aminoglycosides， chloramphenicol， sulfonamides， and tetracycline in the soil were studied. The results showed that 5% content of calcium carbonate was added to soil and UV irradiation time was set for 1 min at 254 nm， which was more conducive to the degradation of the concerned ARGs and was effective for soil remediation.

Keywords： soil remediation;antibiotic resistance genes;high-throughput sequencing;degradation

在全球范圍內，抗生素濫用情況嚴重，加速了抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）在細菌間的傳播，并產生細菌的耐藥性，增加致死率和治病率[1]。ARGs通常位于質粒、轉座子等可動遺傳因子（Mobilegeneticelement）上，由于基因水平轉移（Horizontal Gene Transfer，HGT）作用[2]，致病菌也可從環(huán)境非病原性微生物中獲得ARGs，因此，ARGs不僅在微生物細胞中能夠長久而持續(xù)地傳播，同時細菌也可以通過攝取游離DNA獲取ARGs[3]。目前已有大量研究表明，ARGs在水體和底泥等生態(tài)環(huán)境中廣泛存在[4]，同時土壤也是ARGs的庫源[5]。近些年來，土壤中ARGs及其帶來的抗生素抗性污染受到日益廣泛的關注，但對土壤中的抗性基因處置方式報道較少，而利用紫外消毒技術處理廢水中的ARGs常見于報道[6-7]。

醫(yī)療廢物中常含有病原微生物等有害物質，如果處置不當，使其進入土壤中，可能破壞土壤微生態(tài)，并導致土壤菌群結構發(fā)生改變。針對某醫(yī)療固廢堆放場的污染土壤，本文利用紫外線輻射技術并采用定制的紫外設備，對該抗生素污染土壤進行修復處理，探尋針對該土壤的最佳修復模式。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗土壤采集自蘇州某醫(yī)療廢棄物堆置場地的抗性基因污染區(qū)域土壤，該場地內原從事醫(yī)療廢物的非法處置活動，非法堆放有一次性使用后的輸液玻璃瓶、塑料袋、注射器（針）以及輸液器（針）等醫(yī)療廢棄用品。根據前期場地環(huán)境調查，該堆置范圍的土壤氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類和四環(huán)素類等常用抗生素藥物對應ARGs的豐度和多樣性顯著高于土壤背景值[8]。土壤理化性質如表1所示。

土壤在現場采集后裝入密封袋，然后裝入含有藍冰的滅菌保溫箱，運回實驗室在4 ℃冷藏室保存。土壤基本理化性質如表1所示。

1.2 試驗方法

在不同的土壤樣品中分別加入不同濃度的碳酸鈣，混合均勻后分別采用220 nm和254 nm波長的紫外設備照射土壤樣品。試驗共設計1%和5%兩種濃度的碳酸鈣，選用220 nm和254 nm兩種紫外線波長，紫外照射時間選擇1 min和2 min兩種時間進行處理，以不添加碳酸鈣和未經紫外照射的樣品為對照值。

1.2.1 土壤樣品的處理及制備。直接采用手工篩選方式，去除土壤樣品中的大石塊、植物根系與垃圾等，并將所有土壤人工破碎，混合均勻，過10目篩，將無法通過的大顆粒默認為無污染或輕污染土壤，然后去除。每份土壤取3.0 kg，向不同土壤中分別添加1%、5%的碳酸鈣（分析純），混合均勻。

1.2.2 紫外設備對土壤樣品的處理。本次試驗的紫外設備為非標定制產品，具體結構為裝有紫外燈管的密閉燈盒。盒體由不銹鋼構成，呈長方體，盒體尺寸40 cm×80 cm×20 cm。盒部頂端裝有3根可更換不同波長的紫外燈管，盒部兩端由可移動木塊密封盒體，便于底部土壤取出。試驗時，在不銹鋼密閉盒底部放置一層牛皮不銹紙，其上將專用塑料刮板攤鋪均勻，以肉眼無法觀察到明顯空白為標準。每次換樣時，均需要換用牛皮紙并將不銹鋼密閉盒清理干凈，防止樣品交叉污染。然后，將不銹鋼密封盒關閉，按照試驗要求更換不同波段UV燈管，并控制照射時間。在照射進行到一半時，將暫停照射，人工翻轉土壤一次。

1.2.3 處理后土壤DNA提取及基因檢測。樣品經紫外線處理結束后，取70 g裝入50 mL密封塑料離心管，置于-20 ℃冰箱保存，并盡快送入實驗室檢測。土壤樣品里的微生物采用SDS裂解法配合酚氯仿（25∶24∶1）去除殘余蛋白等雜質進行DNA提取，并使用Qubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）將提取出的DNA定量，進行電泳檢測（見圖1），共送檢42個樣品。接著，根據第一次DNA結果，共選出11個土壤樣品進行測序。

DNA提取后，用Covaris超聲波破碎儀將其隨機打斷，再經過末端修復、加A尾、加測序接頭、純化以及PCR擴增等步驟完成整體的文庫制備工作。構建文庫完成后，首先使用Qubit 2.0進行初步定量，將文庫稀釋，隨后使用Agilent 2100檢測文庫的插入片段。若插入片段大小符合預期，就使用Q-PCR法對文庫的有效濃度進行準確定量。所構建文庫檢測合格后，按照有效濃度和目標數據量的需求將不同文庫的Pooling至Illumina測序芯片進行cBot成簇，然后使用Illumina高通量測序平臺進行測序，采用PE150雙端測序策略。測序數據出來后，通過Factqc（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）對數據進行質控，并去除原始數據中接頭序列、含有N>5%的序列以及SQ<20且堿基大于15%的序列的數據，經過篩選獲得有效數據，建庫流程如圖2所示。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品DNA提取結果

對送檢的42個樣品進行了DNA片段浸提，不同處理條件下，樣品DNA片段浸提效果表現出3種現象，為可浸提的DNA片段充分（易浸提）、可浸提的DNA片段很少（難浸提）、無法浸提有效DNA（無法浸提）。不同處理條件下的浸提結果如表2所示。

由表2可知，無法浸提的DNA片段樣品率在紫外波長254 nm時為37.5%，220 nm時為12.5%。這說明254 nm條件下DNA片段的降解比較充分。

2.2 土壤宏基因組提取與高通量測序

在DNA預試驗的前提下，主要針對254 nm紫外波長處置后的土壤樣品，選擇了11個樣品進行進一步的宏基因組提取與高通量測序，測序質量良好，有效率大于99.7%，Q20>95.5 %，Q30>87.9%，結果如表3所示。

2.3 ARGS在11個土壤樣本中的分布組成

各樣本中不同類型的ARGs豐度圖如圖3所示。本次試驗主要關注4種抗性基因，包括氨基糖苷類（aminoglycosides）、氯霉素類（chloramphenicol）、磺胺類（sulfonamides）和四環(huán)素類（tetracycline）。11個樣本抗生素抗性基因熱圖展示了不同類型抗生素抗性基因豐度，其單位為“抗生素抗性基因拷貝數/16S rRNA gene拷貝數”。

2.4 ARGS多樣性分析

ARGS多樣性分析結果顯示，送檢樣品中所關注的上述氨基糖苷類等4種抗性基因除部分樣品外，大多數有檢出。從表4可看出，對于ARGs aminoglycoside和chloramphenicol來說，紫外照射有效降低了土壤的抗性基因豐度，總體來說，1 min的降低程度優(yōu)于2 min。送檢土壤樣品關注類ARGs亞型豐度的單位為“ARGs 拷貝數/16S rRNA基因拷貝數”。對于ARGs sulfonamide來說，紫外照射時間在2 min時，抗性基因豐度有所降低。對于ARGs tetracycline來說，1 min和2 min均有所降低，但2 min的數據降低趨勢更為明顯。總體來說，紫外照射有效地降低了所關注的4種抗性基因的豐度，從降低的抗性基因種類數來說，1 min的時間優(yōu)于2 min。

當無紫外照射時，1%的碳酸鈣濃度抑制了ARGs aminoglycoside的豐度，而在1 min時，抗性基因豐度隨著碳酸鈣濃度的上升而增加，在2 min時，1%和5%的碳酸鈣濃度均有抑制作用;對于ARGs chloramphenicol來說，碳酸鈣濃度的影響較小;對于ARG ssulfonamide來說，隨著碳酸鈣濃度的增加，抗性基因豐度下降;對于tetracycline來說，碳酸鈣的增加，抗性基因豐度有降低現象，但不是很明顯?？傮w來說，在紫外照射條件下，碳酸鈣濃度影響了抗性基因豐度，有降低現象，尤其在5%時，效果更為明顯。

3 結論

紫外燈在254 nm波長下對土壤進行照射是降解土壤抗生素抗性基因豐度的有效手段之一。綜合考慮來說，添加5%的石灰且使用1 min的紫外照射時間，更有利于土壤中氨基糖苷類（aminoglycosides）、氯霉素類（chloramphenicol）、磺胺類（sulfonamides）、四環(huán)素類（tetracycline）等類型抗生素的降解，該技術對抗性基因污染土壤的修復有實際指導意義。

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