小尾寒羊MYL1 基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆、分析及蛋白表達(dá)

張春蘭

（濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濰坊 261061）

肌球蛋白輕鏈1（Myosin Light Chain 1，MYL1）作為動(dòng)物骨骼肌肌球蛋白的一員，其不同異構(gòu)體的表達(dá)與動(dòng)物體不同類型肌纖維的發(fā)育有關(guān)[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)MYL1基因在斑馬魚的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為快肌纖維的早期階段表達(dá)[2]。MYL1基因?qū)趋兰∩L(zhǎng)和發(fā)育也具有重要的調(diào)控作用。早期研究發(fā)現(xiàn)小鼠背最長(zhǎng)肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)MYL1基因的表達(dá)量較低[3]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該基因在豬[4]和鵪鶉[5]的骨骼肌肌管發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)隨著脊尾白蝦生長(zhǎng)其肌肉組織中MYL1基因表達(dá)量逐漸增加[6]。

目前，關(guān)于MYL1基因表達(dá)調(diào)控的研究較少，尤其在羊上鮮少有報(bào)道。Ling 等[7]利用5'RACE 法克隆了豬背最長(zhǎng)肌中MYL1啟動(dòng)子區(qū)，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)生肌調(diào)節(jié)因子3（MEF3）可能結(jié)合于MYL1基因的+384～+481 區(qū)從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。前期研究[8-9]發(fā)現(xiàn)MYL1基因轉(zhuǎn)錄后在綿羊骨骼肌中有2 種可變剪接體，即MYL1a和MYL1b，且發(fā)現(xiàn)MYL1a和MYL1b在綿羊骨骼肌中的表達(dá)量均顯著高于其他組織，且在生長(zhǎng)速度較快的杜泊羊骨骼肌中的表達(dá)量顯著高于小尾寒羊。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上對(duì)MYL1基因調(diào)控區(qū)進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，并對(duì)該基因編碼蛋白在小尾寒羊各組織間的表達(dá)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究其功能和調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 實(shí)驗(yàn)用小尾寒羊來(lái)自山東魯良優(yōu)質(zhì)肉羊科技示范有限公司。從純種群中任意選取3只，均為雌性，11 月齡。宰殺后迅速取肝、胃、心、肺、背最長(zhǎng)肌、脾、卵巢等組織各2～5 g，立即投入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2MYL1基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆及特征分析

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 將綿羊MYL1基因的2 種可變剪接體MYL1a和MYL1b的cDNA 序列（Genbank 登錄號(hào)分別為KJ700419 和KJ710701）與NCBI 中的預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)，找到序列中的起始密碼子。以起始密碼子上游序列為參考，經(jīng)Primer Premier 5 和DNAClub 軟件設(shè)計(jì)引物（F：5'-GCTCAGAGCCCATAAAGT-3'；R：5'-GGTGGACCCAGAGTGTTA-3'），并由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序分析 參照PCR MasterMix 試劑盒（TIANGEN，KT201）說(shuō)明書，以綿羊基因組DNA為模板對(duì)MYL1基因的啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN，#0691）進(jìn)行純化回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將所得序列用Promoter 2.0 Prediction Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）和CpGislands（http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html）分析CpG 島；用Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子；并以Proscan:Version 1.7（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）和PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）對(duì)TATA box、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)加以分析。

1.3 蛋白表達(dá)分析 取綿羊各組織，以RIPA裂解液（Solarbio，R0010）提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，以SDS-PAGE法進(jìn)行電泳分離。經(jīng)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上后以脫脂奶粉加以封閉，并以兔MYL1 多克隆一抗（RabMAB，EPR9935）孵育過(guò)夜。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（上海雅酶生物科技有限公司，LF102）室溫孵育1 h 后加入ELC Plus 超敏發(fā)光液（Solarbio，PE0010）進(jìn)行顯影和拍照，并以GAPDH 蛋白的表達(dá)水平為參考對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子區(qū)序列 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，MYL1基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增條帶單一，經(jīng)克隆測(cè)序獲得長(zhǎng)為2 454 bp 的啟動(dòng)子區(qū)序列（圖1）。

2.2 啟動(dòng)子和CpG 島的預(yù)測(cè) CpGislands 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中評(píng)分越高，表示其為啟動(dòng)子的可能性越大。如表1所示，MYL1基因有5 個(gè)啟動(dòng)子，其最佳啟動(dòng)子位于2 102～2 152 bp 處。該序列存在2 個(gè)TATA box，分別位于2 117 bp 和898 bp 處；有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS），分別位于2 085 bp 和866 bp 處。該序列無(wú)CpG 島。

表1 MYL1 基因的啟動(dòng)子序列

2.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) 如表2 所示，該啟動(dòng)子區(qū)序列中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)集中于890～1 010 bp 和2 113～2 296 bp 區(qū)域，并且這2 個(gè)區(qū)域中有多個(gè)AP 和TFIID轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。

表2 MYL1 基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子

2.4 小尾寒羊不同組織間MYL1 蛋白表達(dá)差異 如圖2所示，MYL1 蛋白只有一種亞型，其分子量約為21 ku；MYL1 蛋白僅在小尾寒羊骨骼肌中表達(dá)，其他組織中均不表達(dá)。

3 討 論

3.1MYL1基因啟動(dòng)子區(qū)的序列 本研究小尾寒羊MYL1基因有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這同在豬上以RACE 法鑒定得到MYL1基因具有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的研究結(jié)果一致[7]。前期發(fā)現(xiàn)MYL1基因的cDNA 存在2 種可變剪接體（MYL1a和MYL1b），且不同可變剪接體在5'端存在差異[8]，與豬上發(fā)現(xiàn)的MYL1基因外顯子5 發(fā)生可變剪接從而產(chǎn)生多種可變剪接體結(jié)果相一致[7]，說(shuō)明哺乳動(dòng)物中MYL1基因的轉(zhuǎn)錄方式較為多樣化。本實(shí)驗(yàn)所得序列經(jīng)分析無(wú)CpG 島，這與在豬上發(fā)現(xiàn)的MYL1基因有多個(gè)CpG 島的結(jié)果不一致[7]，可能與所用分析軟件不同或不同物種間該基因的啟動(dòng)子區(qū)序列不同有關(guān)。

一般認(rèn)為，組織特異性表達(dá)基因均具有TATA box[10]。本研究中MYL1基因有2 個(gè)TATA box，所以推測(cè)其為組織特異性表達(dá)基因。

軟件分析發(fā)現(xiàn)，MYL1基因存在有AP 和TFIID 轉(zhuǎn)錄因子的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這與前人發(fā)現(xiàn)的這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控起著重要作用相一致[11]，MYL1基因調(diào)控位點(diǎn)集中于890～1 010 bp 和2 113～2 296 bp 兩個(gè)區(qū)域，結(jié)合啟動(dòng)子分析中發(fā)現(xiàn)的最佳啟動(dòng)子位于2 102～2 152 bp 處的分析結(jié)果，為進(jìn)一步分析AP 和TFIID 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)2 102～2 296 bp 區(qū)域啟動(dòng)子區(qū)序列的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)小鼠[12]和豬[7]MYL1基因的啟動(dòng)子區(qū)受到肌肉組織特異增強(qiáng)子元件，如MEF2、MEF3 等的調(diào)控，但本研究中未發(fā)現(xiàn)此類調(diào)控元件的結(jié)合位點(diǎn)，可能與物種有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究證明。

3.2 小尾寒羊不同組織間MYL1 蛋白的表達(dá) 前期研究發(fā)現(xiàn)MYL1基因在綿羊骨骼肌中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織[8-9]。本實(shí)驗(yàn)表明MYL1 蛋白只在小尾寒羊骨骼肌中表達(dá)，在其他組織中均不表達(dá)，該結(jié)果與豬[13]、脊尾白蝦[6]和斑馬魚[2]的研究結(jié)果相一致，并且與序列分析時(shí)得出的“該基因是組織特異性表達(dá)基因”的推測(cè)相一致。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到MYL1 蛋白只有1 種亞型，而前期研究發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄后有多種可變剪接體[8-9]，說(shuō)明該基因雖然轉(zhuǎn)錄水平多樣化，但其翻譯水平是一樣的。

4 結(jié) 論

本研究推測(cè)MYL1基因有多個(gè)啟動(dòng)子，可結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子；該基因?yàn)榫d羊骨骼肌組織特異性表達(dá)的基因；雖然其轉(zhuǎn)錄水平多樣化，但翻譯蛋白只有1 種。