豬RUVBL2 真核表達載體的構建及其在CHO細胞中的表達

徐 楨，陳 云，衛(wèi)恒習，李 莉，孟 立，張守全

（華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東廣州 510642）

隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展及種公豬站越來越廣泛地推廣應用，種公豬精液的品質對養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)濟效益的影響越來越顯著。種公豬射精量少、精子畸形率高、活力弱等不良精液品質表現(xiàn)是導致種公豬繁殖障礙的重要因素。有研究稱，RUVBL2（RuvB-like 2）蛋白在人體睪丸組織中的表達水平遠高于其他組織，這反映了在精子生成和成熟的過程中RUVBL2基因可能發(fā)揮著重要作用[1]。RUVBL2 蛋白與多種細胞的活性相關，并參與了多種細胞活動的過程，包括染色質重塑和基因表達的調節(jié)等[2]。有研究證明，RuvB-like 蛋白在復合物的組裝中起著重要作用，具有分子伴侶的活性[3]。此外，RUVBL2基因特異性地存在于成年小鼠的睪丸和睪丸生精細胞的細胞質和細胞核中，這可能與小鼠精子的成熟或生殖細胞的分化過程相關[4]。但RUVBL2基因在種公豬的精子生成或成熟過程中的作用機理尚不清楚。本研究旨在構建豬的pIRES2-EGFP-RUVBL2 真核表達載體，并將其轉染到CHO 細胞中，進一步觀察豬睪丸組織中的RUVBL2基因能否在CHO 細胞中表達，為研究RUVBL2基因在種公豬精子生成和成熟過程中的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 3 頭15 月齡長白種公豬的睪丸組織、pIRES2-EGFP 質粒和CHO 細胞為本實驗室所保存；無內毒素質粒DNA 小量提取試劑盒、凝膠DNA 微量回收試劑盒、細胞RNA 提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、化學發(fā)光液購自Tiangen 公司；全蛋白提取試劑盒、BAC 蛋白含量檢測試劑盒購自凱基生物技術股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DL2000 DNA Marker、DL 15000 DNA Marker、限制性內切酶、T4 連接酶購自TaKaRa 公司；脂質體轉染試劑購自Gibco 公司；兔源RUVB2 抗體（bs-19836R）購自Bioss 公司；鼠源β-actin抗體（T0022）購自Affinity 公司；HRP 標記山羊抗鼠IgG（E030110）、HRP 標記山羊抗兔IgG（E030120）購自Earthox 公司；DMEM、胎牛血清購自Sigma 公司；Western-blot Marker（180 ku）購自Fermentas 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中RUVBL2基因全長序列（NM_001243867.1），用Primer 5.0 軟件設計引物，上游引物：5'-CGGAATTCATGA CAACCGTGACAGCCA-3'（下劃線為EcoRI 酶切位點）；下游引物：5'-AACTGCAGGGAGGTGTCCAT GGTCTCG-3'（下劃線為PstI 酶切位點），預計PCR產(chǎn)物長度為1 392 bp。引物由廣州艾基生物技術有限公司合成。

1.2.2 目的基因的擴增 分別以3 頭長白種公豬睪丸組織cDNA 為模板，進行目的基因擴增。PCR 反應體系（50 μL）：2× PCR Mix 酶25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板（2.5 ng/μL）2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應程序：94℃ 預變性3 min、94℃變性30 s、62℃ 退火30 s、72℃ 延伸90 s 35 個循環(huán)、72℃徹底延伸10 min。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產(chǎn)物的鑒定及目的基因片段回收。

1.2.3 重組質粒的構建與鑒定 將質粒pIRES2-EGFP和膠回收的PCR 產(chǎn)物分別用EcoRI 酶和PstI 酶進行雙酶切；之后進行16℃ 16 h 目的基因RUVBL2的片段連接，反應體系（15 μL）：DNA 片段（45 ng/μL）9.5 μL、載體質粒pIRES2-EGFP（50 ng/μL）3.2 μL、10×Buffer 1.5 μL、T4 DNA 連 接 酶0.8 μL；最 后 將 連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，涂板，37℃過夜培養(yǎng)，再挑選克隆抽提質粒，用雙酶切法進行陽性克隆鑒定并送至生工生物工程股份有限公司（上海）測序。

1.2.4 脂質體法轉染CHO 細胞 在轉染前一天用0.25%的胰酶消化CHO 細胞并計數(shù)，24 孔鋪板時細胞密度為1×105個/mL，按照脂質體轉染試劑Lipo3000 的說明書將重組質粒轉染至CHO 細胞中。轉染24～48 h 后，用熒光顯微鏡觀察轉染后的表達情況。

1.2.5 轉基因細胞的RT-PCR 使用RNA 提取試劑盒從轉染48 h 的貼壁細胞中提取RNA。反轉錄CHO 細胞的cDNA，第一步反應體系（10 μL）：Oligo dT Primer（50 μmol/L）1 μL、dNTP Mix 酶1 μL、模 板RNA（50 ng/μL）5 μL、RNase Free ddH2O 3 μL,65 ℃5 min、冰上迅速冷卻；第二步反應體系（20 μL）：上步反應液10 μL、5× PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、PrimeScript II RTase 1 μL、RNase Free ddH2O 4.5 μL，42 ℃ 30～60 min、95 ℃ 5 min。CHO 細 胞cDNA 的 RTPCR 反應體系（10 μL）：2× Tap Plus Master Mix 酶5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，CHO 細胞cDNA（10 ng/μL）1 μL，ddH2O 3 μL，94 ℃預變性5 min、94℃ 變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min 32 個循環(huán)、72℃ 徹底延伸7 min 。反應完成后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測。

1.2.6 轉基因細胞的Western-blot 檢驗 將貼壁細胞從壁上刮下來，并轉移至離心管中，室溫下2 000 r/min離心10 min，去除濾液，再用PBS 洗細胞，相同條件下再離心5 min，后再重懸細胞，再次離心5 min，之后使用全蛋白試劑盒提取培養(yǎng)細胞中的蛋白質，并用BAC 蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。將提取純化的CHO 細胞蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)5% 脫脂奶粉的封閉，之后分別進行一抗兔源RUVB2（1:1 000 稀釋）和一抗鼠源β-actin（1:1 000 稀釋）的孵育（搖床上孵育1 h 或者4℃條件下孵育過夜），孵育完成后先后進行10 min/次TBST（2 次）和10 min/次TBS（1 次）的洗膜。洗完膜后，用同樣的方法分別進行HRP 標記山羊抗鼠二抗（1:4 000 稀釋）和HRP 標記山羊抗兔二抗（1:4 000 稀釋）的孵育及二次洗膜，隨后在曝光儀下進行曝光反應。

2 結果與分析

2.1RUVBL2基因的擴增與鑒定 分別以3 頭長白種公豬睪丸組織cDNA 為模板，使用上述引物擴增出睪丸RUVBL2目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1 所示，擴增片段大小約1 392 bp，與預計片段長度相符。

2.2 重組表達載體的PCR 鑒定與雙酶切鑒定 同樣用上述引物進行重組質粒的PCR 鑒定以篩選出陽性克隆質粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示其大小約1 392 bp（圖2-A），后利用限制性內切酶EcoRI 和PstI 對陽性克隆質粒進行雙酶切鑒定，其結果（圖2-B）與預期結果相符。

2.3 重組表達載體的測序鑒定 將重組表達載體送至生工生物工程股份有限公司（上海）進行測序鑒定，結果證明RUVBL2基因已正確地插入到了載體pIRES2-EGFP 的多克隆位點，三聯(lián)密碼閱讀框正確。RUVBL2基因序列使用Blast 分析，結果與原序列吻合度為100%。

2.4 轉基因細胞RUVBL2 融合蛋白的熒光鑒定 將構建成功的pIRES2-EGFP-RUVBL2重組表達載體轉染到CHO 細胞后，恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察熒光結果（圖3），表明pIRES2-EGFP-RUVBL2重組表達載體已成功轉染到了CHO 細胞中。

2.5 轉基因細胞的RT-PCR 鑒定 以轉染了重組表達載體CHO 細胞的cDNA 為模板進行PCR 擴增反應，再用PCR 擴增產(chǎn)物進行β-actin 作為內參的瓊脂糖凝膠電泳，其結果與預期相符（圖4）。

2.6 轉基因細胞的Western-blot 鑒定 以未轉染重組表達載體的CHO 細胞為對照、β-actin 為內參進行Western-blot 鑒定，轉染過重組表達載體pIRES2-EGFP-RUVBL2 的CHO 細胞中有一種相對分子量約為26 ku 的蛋白，其大小與GFP 蛋白大小相一致（圖6）。

3 討 論

RUVBL2 蛋白是細菌DNA 解旋酶RUVB 蛋白在哺乳動物中的同源蛋白[5]。RUVBL2基因在調節(jié)能量代謝、DNA 修復、轉錄、細胞周期調控、應激適應和疾病等過程起著重要作用[6-8]。有研究表明，小鼠早期胚胎的致死與RUVBL1基因和RUVBL2基因有關，并且RUVBL1基因和RUVBL2基因在小鼠早期胚胎發(fā)育開始時起著關鍵作用[9]。同時有研究發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸中RuvB-like 1 蛋白、RUVBL2 蛋白對體內蛋白穩(wěn)定性方面具有獨特的相互依賴作用[10]。另有報道，RuvB-like 1 蛋白、RUVBL2 蛋白與Hsp90 可形成R2TP（Ruvbl1-RUVBL2-Tah1-Pih1）復合物，并且可作為共同伴侶參與多種蛋白復合物的組裝[11]。韓瀠儀[12]通過脂質體轉染法將RUVBL2 siRNA 轉入到人肺纖維細胞，并發(fā)現(xiàn)RUVBL2基因的缺失或表達抑制將會阻礙DNA 損傷修復的應答進程。鄭英等[5]構建了人RUVBL2真核表達載體，并使其能夠在HeLa 細胞中表達。本研究發(fā)現(xiàn)，長白種公豬的睪丸組織中特異性地存在著RUVBL2基因，這可能與公豬的生殖細胞分化過程有關，RUVBL2基因可能在其中參與DNA 復制、重組等過程。然而，目前國內外對RUVBL基因的研究多來自于鼠源和人源，并未發(fā)現(xiàn)有豬源RUVBL2基因的相關研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)并構建了豬源RUVBL2真核表達載體pIRES2-EGFP-RUVBL2，并成功地轉入到了CHO 細胞，這一實驗結果證實了種公豬睪丸組織中的RUVBL2基因能夠在CHO 細胞中表達，對種公豬睪丸組織中RUVBL2基因在體外異源細胞中的表達有了新的認識，為種公豬體外研究RUVBL2基因對種公豬精子生成和成熟過程中的作用機理奠定了理論基礎。

4 結 論

本實驗從豬的睪丸組織中克隆出了RUVBL2基因，并構建了豬的RUVBL2真核表達載體pIRES2-EGFPRUVBL2，同時借助脂質體將重組表達載體成功地轉入到了CHO 細胞，證實了豬睪丸組織中的RUVBL2基因能夠在CHO 細胞中表達。