香爐山雞隱性白羽鑒定分析

李興才，潘成勇，李 輝*，楊華婷，陳 林

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.凱里鳳凰苑畜牧養(yǎng)殖有限公司，貴州凱里 556000）

雞的羽毛顏色受多個(gè)等位基因控制，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在5 對(duì)等位基因，分別為抑制色素形成基因I、色素原基因C、氧化酶基因O、抑制色素表現(xiàn)基因P以及非白化基因A，其中只有I基因和C基因已分別被定位于PMEL17與TYR基因上，其他基因未見(jiàn)報(bào)道[1]。I基因存在時(shí)，無(wú)論其他基因是否顯隱性都表現(xiàn)為白羽型，因此通常被稱為顯性白羽；隱性白羽情況比較復(fù)雜，但目前為止對(duì)于C基因控制的白羽研究比較多，因此由C基因控制的白羽通常稱為隱性白羽。Kerje 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，PMEL17基因第十外顯子區(qū)域插入了一段9 bp 的核苷酸序列導(dǎo)致黑色素基因非正常轉(zhuǎn)錄翻譯，引起顯性白羽產(chǎn)生。Chang 等[3]研究得出TYR（絡(luò)氨酸酶基因）第四內(nèi)含子區(qū)域插入了一段長(zhǎng)7.7 kp 的內(nèi)源性白血病病毒ALV 序列，導(dǎo)致TYR基因轉(zhuǎn)錄物中缺少第五外顯子編碼的跨膜結(jié)構(gòu)域而無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄，從而使絡(luò)氨酸酶失去正常功能活性，致使黑色素?zé)o法合成，導(dǎo)致隱性白羽形成。中國(guó)消費(fèi)者對(duì)雞羽毛顏色具有一定偏好，認(rèn)為白色是一種不吉利的顏色，因此本研究對(duì)雞群白羽與有色羽鑒定具有一定的研究?jī)r(jià)值。

香爐山雞系貴州省凱里地區(qū)苗族人民從中原遷徙到西南后，在香爐山區(qū)域長(zhǎng)期封閉的自然條件下形成的原始類群，主要分布于貴州省黔東南凱里、麻江、黃平、丹寨等縣。香爐山雞體型矮小、結(jié)實(shí)緊湊、結(jié)構(gòu)勻稱，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、無(wú)應(yīng)激、抗病能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)[4-5]。在香爐山雞群體中，有千分之二左右的白羽雞出現(xiàn)，經(jīng)研究分析為隱性白羽等位基因造成，其中雜合子個(gè)體表型與顯性純合子表現(xiàn)一致，但部分雜合子雞群翅膀和尾部羽毛出現(xiàn)白斑現(xiàn)象，因此凱里鳳凰苑畜牧養(yǎng)殖有限公司計(jì)劃在香爐山雞選育中剔除雜合子個(gè)體，建立麻羽和白羽2 個(gè)品系。采用傳統(tǒng)選育一般要連續(xù)幾個(gè)世代才能淘汰雜合子雞群，耗時(shí)耗力，本研究利用分子輔助標(biāo)記技術(shù)對(duì)香爐山雞隱性白羽進(jìn)行鑒定，成本低廉、準(zhǔn)確度高，只需一代就能淘汰全部雜合子，能夠有效縮短育種周期，加快育種進(jìn)展。本研究將為香爐山雞種質(zhì)資源保護(hù)、開(kāi)發(fā)與利用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用的香爐山雞來(lái)自貴州省黔東南州凱里市鳳凰苑畜禽養(yǎng)殖有限公司種雞擴(kuò)繁場(chǎng)，其中有色羽60 只、白羽60 只，公母各半。使用EDTA 抗凝管翅靜脈采血，采血過(guò)程中快速顛倒混勻，置于低溫泡沫盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存用于總DNA 提取。

1.2 基因組DNA 提取 利用血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）對(duì)香爐山雞基因組DNA 進(jìn)行提取，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，OD 值在1.8～2.0 為合格。利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，合格DNA 樣品分裝于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 發(fā)布的TYR基因第四內(nèi)含子序列含ALV 插入序列結(jié)合TYR第四內(nèi)含子未含插入序列作為參考，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 和Oligo 6.0 進(jìn)行多重PCR 引物設(shè)計(jì)。NCBI上參考序列GenBank 登錄號(hào)分別為DQ118701.1 和DQ118702.1。引物設(shè)計(jì)特點(diǎn)是共用同一條上游引物，總共2 對(duì)3 條引物，分別命名為F、R1、R2。引物F：5'-GGGAAACTTTAAGGACTGGTGGA-3'，R1：5'-CTG GGTAGATGGACAGACCGTTG-3'，R2：5'-CAAGAGG CACAAGGAGTGGGACA-3'，序列送往上海英濰捷基生物有限公司進(jìn)行引物合成。

PCR 擴(kuò)增運(yùn)用15 μL 反應(yīng)體系：1 個(gè)上游和2 個(gè)下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，（80 ng/μL）模板DNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 7 μL，ddH2O 4 μL。反 應(yīng) 條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s、59.2℃退火45 s、72℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8 min，4℃保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 將香爐山雞隱性白羽基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0% 的瓊脂糖凝膠、130 V 電泳30min 進(jìn)行檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行拍照讀取。根據(jù)鑒定結(jié)果挑選2 種純合子PCR 產(chǎn)物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，應(yīng)用Popgene2.1 軟件對(duì)香爐山雞鑒定結(jié)果進(jìn)行平均等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shanon 指數(shù)、多態(tài)信息含量（PIC）、等位基因頻率、基因型頻率等計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 隱性白羽C 基因鑒定分析 本研究提取的DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰明亮，無(wú)嚴(yán)重拖帶，說(shuō)明提取效果較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)利用2 對(duì)3 條F、R1、R2 引物對(duì)120 只香爐山雞隱性白羽基因型進(jìn)行雙重PCR 鑒定分析。結(jié)果顯示PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中產(chǎn)生3 種類型的條帶，其中只能夠得出169 bp 條帶的待測(cè)雞等位基因型為cc 的隱性白羽純合型，只得出526 bp 條帶的待測(cè)雞等位基因型為CC 的有色羽純合型；如果同時(shí)得出169 bp 和526 bp 2條帶的待測(cè)雞等位基因型為Cc 的有色雜合型，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1～5 所示。統(tǒng)計(jì)得出CC 型為56 個(gè)，占總?cè)后w46.67%；Cc 型為4 個(gè)，占3.33%；cc 為60 個(gè)，占50%。能夠成功鑒定出隱性白羽cc 型與尾部白斑雜合子Cc 型，為香爐山雞剔除雜合子建立2 個(gè)純合子雞群提供理論依據(jù)。鑒定出60 只白羽雞群全部為隱性純合，60 只有色羽樣品未出現(xiàn)隱性白羽純合基因型，與表現(xiàn)型結(jié)果一致，說(shuō)明鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

利用Popgene 2.1 軟件對(duì)隱性白羽C 基因多態(tài)性分析得出Na 為2、Ne 為1.997 8，如表1 所示。Shannon指數(shù)為0.692 6、PIC 為0.374 7，0.25＜PIC＜0.50，該位點(diǎn)為中度多態(tài)，Shannon 指數(shù)與PIC 具有一致性，說(shuō)明香爐山雞隱性白羽基因多態(tài)性比較豐富，具有一定的選育空間。

3 討 論

雞的羽毛顏色性狀是消費(fèi)者比較關(guān)心的質(zhì)量性狀。羽毛顏色種類繁多，主要分為有色羽和白羽兩類。羽色形成過(guò)程比較復(fù)雜，受多種色素原基因控制[6]，正是這樣形成了各具特色的地方品種資源。在香爐山雞選育中發(fā)現(xiàn)隱性白羽的存在，雞群白羽基因雜合子中部分出現(xiàn)翅膀和尾部白斑現(xiàn)象，為更好地保護(hù)、開(kāi)發(fā)、利用這一類群，本研究采用分子輔助標(biāo)記選育方法，利用多重PCR 結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，快速鑒定分離淘汰雜合子。相對(duì)于傳統(tǒng)的選育方式，該方法成本低廉、準(zhǔn)確度高、省時(shí)省力，同時(shí)具備有效縮短育種周期、加快育種進(jìn)展等優(yōu)點(diǎn)，有利于香爐山雞2 個(gè)核心群快速建立，防止優(yōu)良的地方種質(zhì)資源流失。

隱性白羽主要是色素原基因C起主導(dǎo)作用，它被定位于TYR基因上。TYR是一種含銅的金屬酶，是黑色素形成的關(guān)鍵酶[7]，而黑色素是否表達(dá)與隱性白羽的形成密切相關(guān)。研究證明TYR基因第四內(nèi)含子區(qū)域插入內(nèi)源性白血病病毒ALV 序列，導(dǎo)致隱性白羽形成[8]。因此，本研究利用TYR基因的這一特性，合理地設(shè)計(jì)出鑒定隱形白羽的雙重PCR 引物，成功鑒定分離香爐山雞隱性白羽，同時(shí)成功淘汰該類群隱性白羽雜合子，建立麻羽與隱性白羽2 個(gè)純合群體。

表1 香爐山雞隱性白羽基因位點(diǎn)多態(tài)性

隱性白羽純合雞具有體格健壯、性情溫順、繁殖性能好等特點(diǎn)[9]，用于其他品種的改良可以對(duì)繁殖性能、生長(zhǎng)性能等方面進(jìn)行改進(jìn)，由于白羽對(duì)其他羽色為隱性的緣故，因此不會(huì)大面積改變改良品種羽毛顏色，只是翅膀與尾部出現(xiàn)部分白斑，因而能夠最大程度保持原品種性狀特征[10-13]，因此可以嘗試將隱性白羽雞群作為其他品種的改良材料。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)120 只香爐山雞隱性白羽進(jìn)行鑒定分析，經(jīng)雙重PCR 擴(kuò)增結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)成功鑒定隱性白羽基因型，將香爐山雞雜合子雞淘汰，建立2 個(gè)純合雞群；對(duì)隱性白羽基因位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，PIC 為0.374 7，屬于中度多態(tài)，說(shuō)明該品種具有一定的選育空間。