荷斯坦泌乳牛4 種炎性細(xì)胞因子隨胎次變化規(guī)律的研究

王 凱，陳紫薇，張國(guó)興，常 瑤，張海亮，董剛輝，王雅春*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100176）

北京地區(qū)中國(guó)荷斯坦牛使用年限較短，被動(dòng)淘汰比例高，平均利用胎次為2.86 胎[1]。由于年齡增加，高胎次奶牛免疫系統(tǒng)狀態(tài)發(fā)生改變，影響奶牛對(duì)疾病的抵抗力，淘汰風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[2]。炎性細(xì)胞因子由促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子組成，與機(jī)體固有免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。促炎細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin1-β，IL-1β）等，主要由巨噬細(xì)胞分泌[3]。抑炎細(xì)胞因子主要包括白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）等[3]。病原體入侵時(shí)，促炎細(xì)胞因子激活機(jī)體的先天和獲得性免疫，放大炎癥反應(yīng)，而抑炎細(xì)胞因子則主要是在消滅病原體后消除炎癥使機(jī)體恢復(fù)到正常免疫和生理水平[4-5]。促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)中聯(lián)系機(jī)體與損傷因子的樞紐，炎性細(xì)胞因子間動(dòng)態(tài)的相互作用和平衡是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[6]。

目前，關(guān)于病理狀態(tài)下奶牛細(xì)胞因子變化的研究已有很多，而鮮有健康奶牛炎性細(xì)胞因子隨胎次變化規(guī)律研究的報(bào)道。本研究選取150 頭健康的荷斯坦奶牛，分析血液中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和抑炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β濃度以及奶牛生產(chǎn)性能，探究生理狀態(tài)下炎性細(xì)胞因子隨胎次變化的規(guī)律，為免疫預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)牛來自北京市5 個(gè)牧場(chǎng)（F1～F5），每場(chǎng)30 頭，共150 頭健康的中國(guó)荷斯坦泌乳牛，其中1 胎、3 胎、5 胎及以上各50 頭。

1.2 樣品的采集和處理 使用一次性無菌采血針和非抗凝真空采血管于2017 年7 月至8 月采集試驗(yàn)牛尾根靜脈血，同一牛場(chǎng)的血樣采集工作在同一天下午完成。采集血樣時(shí)進(jìn)行體況評(píng)分和直腸溫度測(cè)定。非抗凝血靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，取上層清液，儲(chǔ)存在-20℃的冰箱，以備測(cè)細(xì)胞因子。奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（Dairy Herd Improvement，DHI）數(shù)據(jù)來自北京奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 炎性細(xì)胞因子 血清炎性細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-6、IL-10 和TGF-β）是由金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司采用ELISA 酶免法測(cè)定，酶標(biāo)儀是上海科華生物工程有限公司生產(chǎn)的ST-360 型，細(xì)胞因子診斷試劑為金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.3.2 體況評(píng)分（BCS） 評(píng)定時(shí)奶牛自然站立，3 名評(píng)分人員通過目測(cè)和觸摸奶牛隱窩、臀角及腰角等部位，獨(dú)立進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分采用5 分制評(píng)分系統(tǒng)，精確至0.5 分，分析時(shí)使用3 名評(píng)定人員評(píng)分的均值[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)整理 本研究共測(cè)定150 頭中國(guó)荷斯坦牛的血液炎性細(xì)胞因子濃度，匹配距采樣日最近3 個(gè)月的DHI 記錄，計(jì)算日產(chǎn)奶量、校正日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率的3 次測(cè)定日均值用于后續(xù)分析。剔除分析所用產(chǎn)奶性能指標(biāo)DHI 記錄缺失≥2 次的個(gè)體，經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共150 頭個(gè)體數(shù)據(jù)可用于分析血液炎性細(xì)胞因子隨胎次的變化規(guī)律，137 頭個(gè)體數(shù)據(jù)用于分析血液炎性細(xì)胞因子對(duì)產(chǎn)奶性能的影響。

胎次劃分為3 個(gè)水平：1 胎、3 胎、5 胎及以上；泌乳天數(shù)分為2 個(gè)階段：泌乳天數(shù)74～216 d 為泌乳中期，大于216 d 為泌乳后期。研究血液炎性細(xì)胞因子對(duì)產(chǎn)奶性能的影響時(shí)，按中位數(shù)將炎性細(xì)胞因子分為高含量組和低含量組，作為分類變量進(jìn)行分析。

1.4.2 炎性細(xì)胞因子隨胎次的變化規(guī)律 使用SAS 9.4軟件GLM 過程（Bonferroni t 檢驗(yàn)用于多重比較），采用固定模型1 分析TNF-α、IL-6、IL-10 和TGF-β隨胎次的變化規(guī)律：

式 中，Y表示TNF-α、IL-6、IL-10或TGF-β；μ為 總體平均數(shù)；farm為牛場(chǎng)效應(yīng)（i=1～5）；parity為胎次效應(yīng)（j=1～3）；lactation為泌乳階段效應(yīng)（k=1～2）；α為TNF-α的回歸系數(shù)，β為IL-6 的 回歸系數(shù)，γ為IL-10 的回歸系數(shù)，δ為TGF-β的回歸系數(shù)；當(dāng)Y為TNF-α?xí)r，α=0，當(dāng)Y為IL-6 時(shí)，β=0，當(dāng)Y為IL-10 時(shí)，γ=0，當(dāng)Y為TGF-β時(shí)，δ=0；eijkl為隨機(jī)殘差。

使用SAS 9.4 軟件CORR 過程計(jì)算每一胎次內(nèi)4種炎性細(xì)胞因子之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，分析4 種炎性細(xì)胞因子間的相關(guān)性。

1.4.3 炎性細(xì)胞因子對(duì)產(chǎn)奶性能的影響 使用SAS 9.4軟件GLM 過程（Bonferroni t 檢驗(yàn)用于多重比較），采用固定模型2 分析炎性細(xì)胞因子對(duì)產(chǎn)奶性能的影響：

式中，Y表示日產(chǎn)奶量、校正日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率或乳糖率；μ為總體平均數(shù)；farm、parity和lactation效應(yīng)定義同前模型；Gtnf為TNF-α分組效應(yīng)（l=1～2）；Gil6為IL-6分組效應(yīng)（m=1～2）；Gil10為IL-10 分組效應(yīng)（n=1～2）；Gtgf為TGF-β分組效應(yīng)（o=1～2）；BCS 為體況評(píng)分，α為BCS 回歸系數(shù)；eijklmnop為隨機(jī)殘差。

本研究結(jié)果以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 炎性細(xì)胞因子濃度隨胎次變化規(guī)律 由表1 可見，不同牛場(chǎng)對(duì)于IL-10 和 TGF-β有顯著影響，而不同泌乳階段對(duì)IL-10 和TNF-α有顯著影響。

總體來說，IL-6、TGF-β隨胎次升高降低，TNF-α隨胎次升高有先降低后升高趨勢(shì)，IL-10 隨胎次變化不明顯。胎次對(duì)TNF-α和IL-10 沒有顯著影響，從平均值來看，5 胎及以上胎次牛TNF-α高于3 胎。IL-6 及TGF-β在不同胎次間差異顯著，5 胎及以上胎次牛IL-6及TGF-β顯著低于1 胎和3 胎牛，而IL-6 水平在1 胎和3 胎牛之間沒有顯著差異。

從圖1 可以看出，1 胎牛IL-6 和TGF-β顯著正相關(guān)，IL-10 和TGF-β顯著負(fù)相關(guān)；3 胎牛IL-6 和TGF-β顯著正相關(guān)；5 胎及以上胎次奶牛各細(xì)胞因子間均無顯著相關(guān)。

2.2 產(chǎn)奶性能影響因素分析 由表2 可知，不同牛場(chǎng)對(duì)日產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率影響顯著，不同泌乳階段對(duì)日產(chǎn)奶量、校正日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率影響顯著，日產(chǎn)奶量、蛋白率、乳糖率對(duì)BCS 回歸顯著。

表1 各固定效應(yīng)對(duì)炎性細(xì)胞因子濃度的影響

總體來說，高胎次奶牛產(chǎn)奶性能下降。5 胎及以上胎次奶牛的日產(chǎn)奶量和乳糖率顯著低于1 胎和3 胎；5胎及以上胎次校正日產(chǎn)奶量低于1 胎和3 胎，與3 胎差異顯著。胎次對(duì)乳蛋白率和乳脂率沒有顯著影響，從平均值來看，5 胎及以上胎次乳脂率低于3 胎。

TNF-α對(duì)日產(chǎn)奶量有顯著影響，IL-10 對(duì)校正日產(chǎn)奶量和乳脂率有顯著影響，IL-6 和TGF-β對(duì)生產(chǎn)性能各項(xiàng)指標(biāo)影響均不顯著。高TNF-α組奶牛日產(chǎn)奶量顯著低于低TNF-α組，最小二乘均值相差2.08 kg（表2）；高IL-10 組奶牛乳脂率和校正日產(chǎn)奶量均顯著高于低IL-10組，最小二乘均值相差分別為0.23%和5.85 kg（表2）。

3 討 論

各種細(xì)胞因子的促炎或抑炎活性并不是絕對(duì)的[8]，促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子之間的相互作用對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。因此，不能單純地從炎性細(xì)胞因子水平來說明個(gè)體健康狀況是否良好，研究中應(yīng)該謹(jǐn)慎解釋炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律。

TNF-α是一類高度促炎癥的細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接抑制增殖和壞死作用，但對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)分化及其代謝功能的發(fā)揮無影響[9]。此外，TNF-α還可通過活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的產(chǎn)生來介導(dǎo)免疫應(yīng)答[10]。炎癥發(fā)生時(shí)，TNF-α促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的激活以及白細(xì)胞在感染部位的募集，參與多種炎癥反應(yīng)[11]。馮士彬等[4]研究表明，奶牛血清中TNF-α水平與乳房炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，TNF-α能夠指示炎癥發(fā)生程度。在小鼠和人類研究中有報(bào)道，衰老的個(gè)體處于慢性炎癥狀態(tài)（簡(jiǎn)稱inflame-aging），血液TNF-α含量升高，這種慢性炎癥狀態(tài)很可能是高齡個(gè)體容易生病、身體脆弱的主要原因[12-13]。本研究中，奶牛也有類似的狀況，5 胎以上奶牛日產(chǎn)奶量顯著降低，TNF-α濃度相比3 胎奶牛有所升高，且高TNF-α組奶牛產(chǎn)奶量比低TNF-α組奶牛平均低5%左右，表明日產(chǎn)奶量的下降可能與促炎細(xì)胞因子TNF-α的增加有關(guān)。

IL-6 由2 型輔助T 淋巴細(xì)胞（Type2 Helper Cells，Th2）分泌，作為一種淋巴細(xì)胞刺激因子，可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體分泌[14-15]，參與調(diào)節(jié)各種層面的固有免疫和獲得性免疫，是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成成分，與體內(nèi)感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，IL-6 隨胎次變化的趨勢(shì)與抗炎因子IL-10、TGF-β相同。IL-6 的促炎活性已得到公認(rèn)，但相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)其具有抗炎活性[18]。

IL-10 是介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子，由2 型輔助T淋巴細(xì)胞分泌，能夠促進(jìn)體液免疫，調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞的活性和其他炎性細(xì)胞因子的生成[19]。IL-10 通過抑制單核/巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能，抑制1 型輔助T 淋巴細(xì)胞（Type1 Helper Cells，Th1）生成減少促炎因子的釋放，減少淋巴細(xì)胞向炎癥部位轉(zhuǎn)移，是機(jī)體內(nèi)的主要抗炎因子[20]。本研究中，IL-10 隨著胎次升高有降低趨勢(shì)，且低IL-10 組乳脂率和校正日產(chǎn)奶量顯著低于高IL-10 組，表明高胎次奶牛IL-10 的降低可能通過影響炎癥反應(yīng)的平衡進(jìn)而影響奶牛產(chǎn)奶性能。

TGF-β是一類多功能的細(xì)胞因子，廣泛參與哺乳類動(dòng)物的各種病理生理過程，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、骨骼改建、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及腫瘤防治等過程中發(fā)揮重要作用，協(xié)同其他細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜功能，維持子宮內(nèi)膜和組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[6]。TGF-β主要由活化的T 細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，通過抑制淋巴細(xì)胞增殖分化以及細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的成熟，并抑制巨噬細(xì)胞的激活，表現(xiàn)為抗炎活性[8]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β隨胎次升高顯著降低，且與IL-10、IL-6 的相關(guān)性發(fā)生變化，1 胎和3 胎奶牛TGF-β和IL-6、IL-10 存在顯著的相關(guān)關(guān)系，5 胎及以上奶牛各細(xì)胞因子間均無顯著相關(guān)。在機(jī)體感染或發(fā)生炎癥時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)中促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，綜合應(yīng)對(duì)感染[21]。TGF-β的這種變化可能會(huì)影響高胎次奶牛對(duì)炎癥反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)能力。

表2 SAS GLM 模型分析各固定效應(yīng)對(duì)產(chǎn)奶性能的影響

4 結(jié) 論

本研究通過分析荷斯坦奶牛4 種血液炎性細(xì)胞因子隨胎次的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)1 胎和5 胎以上奶牛TNF-α偏高，IL-6、IL-10、TGF-β隨胎次升高有降低趨勢(shì)；高TNF-α組奶牛產(chǎn)奶量顯著低于低TNF-α組，高IL-10 組奶牛乳脂率和校正日產(chǎn)奶量顯著高于低IL-10組。結(jié)果表明高胎次奶牛炎性細(xì)胞因子的變化可能與生產(chǎn)性能的降低有關(guān)。