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    眼斑芫菁在斑蝥素合成期的抑制性消減雜交文庫構(gòu)建及分析

    2020-03-07 08:24:42張利萍殷幼平
    關(guān)鍵詞:文庫雄性成蟲

    王 宇, 張利萍, 殷幼平

    (1.攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,四川 攀枝花617000; 2.攀枝花學(xué)院 附屬醫(yī)院,四川 攀枝花617000;3.攀枝花學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院,四川 攀枝花617000; 4.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院,重慶400030)

    斑蝥素主要來源于芫菁科昆蟲中的眼斑芫菁,是我國《藥典》里面記載的一種傳統(tǒng)動物藥材[1].近年來發(fā)現(xiàn),斑蝥素及其衍生物如去甲斑蝥素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或者抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和增殖[2],對于治療肝癌、淋巴癌、胃癌等腫瘤有很好的療效[3-5].

    眼斑芫菁斑蝥素合成具有性二型現(xiàn)象,雌性成蟲合成斑蝥素很少,主要由雄性成蟲合成.此外,雄性成蟲在不同發(fā)育階段其斑蝥素合成量具有顯著的差異.雄性成蟲羽化后第1—10 天雄性成蟲合成斑蝥素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.114% ~0.237%,羽化后第20—25 天斑蝥素質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇增加,從0.486%增加到0.942%,達(dá)到斑蝥素合成的高峰期[6].同時,通過SDS-PAGE 和雙向電泳技術(shù)分析蘋斑芫菁在斑蝥素合成前期、大量合成早期和末期的蛋白質(zhì)組成的變化,發(fā)現(xiàn)3 個時期蛋白質(zhì)組成的變化趨勢與芫菁合成斑蝥素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著峰值變化相一致,表明芫菁體內(nèi)斑蝥素的合成是由多種蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程[7].目前,由于眼斑芫菁的斑蝥素合成途徑仍不清楚,所以本研究通過構(gòu)建SSH篩選眼斑芫菁在斑蝥素合成期的差異表達(dá)基因,這為闡明斑蝥素合成途徑奠定基礎(chǔ).

    1 材料和方法

    1.1 材料眼斑芫菁成蟲采自貴州省羅甸縣,采回后在實驗室內(nèi)以室溫(30 ± 1)℃、相對濕度75% ±5%、光周期14 hL/10 hD 的條件下飼養(yǎng),收集羽化后第6—10 天和第21—25 天的雄性成蟲作為供試材料.

    1.2 主要試劑和儀器主要試劑包括TRIzol試劑(購于Invitrogen公司)、PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和SMART PCR cDNA Synthesis Kit(購于Clontech 公司)、RNase -free DNaseI(購于Fermentas公司)、mRNA純化試劑盒和pMD18 -T 克隆載體試劑盒(購于TaKaRa 公司)、標(biāo)記探針的DIG High Primer Kit(購于Roche 公司)、熒光定量PCR試劑盒(購于Bio -RAD 公司)、DNA 純化試劑盒(購于AXYGEN 公司).主要儀器包括凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、PCR儀(Bio -Rad)、DU640 紫外分光光度計(Beckman).菌株JM109 為本實驗室保存.所用引物及測序分別委托上海生工公司和華大基因公司完成.

    1.3 方法

    1.3.1 樣本采集 分別取隔離飼養(yǎng)羽化后第6—10 天的雄性成蟲(driver)和第21—25 天的雄性成蟲(tester),液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中,-80 ℃保存,供提取RNA.

    1.3.2 總RNA 提取和mRNA 純化 按照Invitrogen 公司提供的操作指南提取總RNA,然后用RNase-free DNaseI 進(jìn)行處理,隨后按照mRNA 純化試劑盒說明書要求純化mRNA,用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA 的完整性和純度.

    1.3.3 消減雜交文庫的構(gòu)建 參照消減文庫試劑盒說明進(jìn)行.將實驗組(tester)和驅(qū)動組(driver)的cDNA用RsaⅠ酶酶切和連接頭,2 組混合經(jīng)2 次液相雜交和2 次PCR 擴(kuò)增,最后將PCR 產(chǎn)物插入到pMD-18T載體中,導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞JM109,構(gòu)建成cDNA消減雜交文庫.

    1.3.4 斑點雜交篩選 用巢式PCR引物對插入的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增后,按照DIG High Primer Kit 說明進(jìn)行斑點雜交,進(jìn)一步去除假陽性克隆.

    1.3.5 測序和序列分析 將點雜交陽性克隆送華大基因公司測序,用DNA Star軟件將測序序列除去兩端載體序列和接頭序列,即得到EST 序列;用PHRAP拼接程序?qū)㈩A(yù)處理后的EST序列進(jìn)行聚類分析、數(shù)據(jù)拼接.將ESTs 提交到Genbank(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov.)的BLASTN 和BLASTX,對拼接后所得非冗余序列進(jìn)行同源性比對,確定各序列對應(yīng)的基因功能.使用KEGG 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.genome.jp/kegg/)和AMIGO(http:/ /amigo.geneontology.org/cgi - bin/amigo/go.cgi)對所得ESTs進(jìn)行基因功能分析,全部ESTs 提交NCBI 的dbEST數(shù)據(jù)庫.

    1.3.6 差異表達(dá)基因的熒光定量檢測 隨機(jī)抽取9 個EST序列,使用Primer 5.0 軟件設(shè)計特異性定量PCR引物,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行引物特異性比對,引物具體信息見表1.以TAF5、UBE3A 和RPL22e為內(nèi)參基因,用qRT -PCR 對差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證.反應(yīng)體系(25 μL)為:1 μL cDNA、12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM II(2 ×)、上下游引物(10 μmol/L)各0.5和10.5 μL 水.反應(yīng)體系為:95 ℃預(yù)變性10 min;然后95 ℃變性15 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s進(jìn)行42 個循環(huán),添加熔解曲線,確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,每個樣品重復(fù)測定3次.采用IQ5 軟件對qRT-PCR得到的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

    表1 qRT-PCR分析中的基因的引物序列Tab.1 The primers of selected genes analyzed by qRT-PCR

    2 結(jié)果

    2.1 RNA的檢測經(jīng)紫外分光光度計檢測,tester和driver總RNA的A260/A280比值在1.85 ~2.0之間,表明純度較高.經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,總RNA的18S和28S rRNA條帶清楚,無任何拖尾現(xiàn)象,表明沒有發(fā)生降解,完整性好(圖1).用紫外分光光度計測定分離的mRNA,其A260/A280 比值在1.9 ~2.0 之間,mRNA 總量為3.0 μg,表明mRNA的純度和質(zhì)量滿足構(gòu)建文庫的要求.

    2.2 斑點雜交分別以正向消減和反向消減的cDNA作為正向和反向探針,利用斑點雜交對本文庫中的1 500 個克隆進(jìn)行篩選,在正向探針的雜交結(jié)果中顯示為陽性信號,而在反向探針的雜交結(jié)果中顯示為陰性信號或正向探針雜交信號明顯強(qiáng)于反向探針雜交信號的克隆作為陽性克?。▓D2).經(jīng)過篩選,選出陽性克隆285 個.

    圖1 總RNA凝膠電泳鑒定Fig.1 The electrophoresis identification of total RNA

    圖2 斑點雜交結(jié)果Fig.2 Differential screening of positive clones by dot blotting

    2.3 測序結(jié)果和分析對文庫中的285 個差異表達(dá)克隆進(jìn)行測序分析.利用DNAStar和PHRAP軟件對EST序列去除載體序列和接頭序列,聚類分析、數(shù)據(jù)拼接,共拼接成130條ESTs,其中72條singletons,58條contigs,將處理后的ESTs提交到Genbank進(jìn)行blastn比對.在130條ESTs中,34條(26%)與假設(shè)蛋白質(zhì)基因有同源性;51 條(39%)與已知功能蛋白基因有同源性;而剩下的45 條(35%)與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性,可能代表了新的未知功能基因(圖3).對51 條己知功能的同源ESTs 進(jìn)行功能分析,這些基因涉及多種代謝和應(yīng)答過程,如生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和解毒、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝和合成等(表2).所有ESTs提交到NCBI中的dbEST數(shù)據(jù)庫,序列號為JZ139169-JZ139298.

    圖3 130 條ESTs序列的功能分類Fig.3 Functional classification of 130 ESTs

    2.4 差異表達(dá)基因的qRT -PCR 檢測為了準(zhǔn)確鑒定SSH 文庫中差異表達(dá)基因的可靠性,使用qRT -PCR分析9個EST序列在第6—10天和第21—25 天的雄性成蟲中的表達(dá)變化.在這些EST序列中,有3 個基因是編碼已知蛋白的基因,分別預(yù)測的是轉(zhuǎn)錄因子myb(JZ139170)、細(xì)胞色素P450單加氧酶(JZ139184)、異檸檬酸脫氫酶(JZ139199)和3 個假設(shè)蛋白質(zhì)基因JZ139223、JZ139225、JZ139236);其余3 個基因是未知功能基因.結(jié)果顯示這9 個基因在雄性成蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)水平差異從(3.8 ±1.1)倍到(14.5 ±2.1)倍變化,差異顯著(圖4).

    表2 部分ESTs與已知基因的同源性比較Tab.2 Partial ESTs similarity analysis by comparing with the identified function genes in Genbank

    表2 (續(xù))

    圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析Fig.4 qRT-PCR analysis of differentially expressed genes

    3 討論

    通過構(gòu)建SSH文庫,共篩選到130 個在眼斑芫菁雄性成蟲斑蝥素合成高峰期特異表達(dá)的基因,其中65%的ESTs與NR庫中的蛋白質(zhì)有高度的同源性,涉及多種代謝和應(yīng)答過程,如生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和解毒、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝與合成等,表明芫菁體內(nèi)斑蝥素的合成是由多種蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程.而35%的ESTs與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性,可能代表了新的未知功能基因,由于目前昆蟲的遺傳信息比較缺乏,而鞘翅目昆蟲的遺傳背景更為缺失,因此這些基因的功能尚不清楚.

    現(xiàn)有研究表明斑蝥素是一類倍半萜的衍生物,而倍半萜的形成需要通過甲羥戊酸途徑(MVA)[8-10].此外,McCormick 等[11]以原野豆芫菁雄性為材料,同位素18O 標(biāo)記氧氣或水的實驗證明,原野豆芫菁的斑蝥素是由降解的法尼醇的碳骨架生成,斑蝥素中的四氫呋喃環(huán)上的氧原子及另外2 個氧原子都來自分子氧,另外一個氧原子來自于水,并提示斑蝥素可能是保幼激素(JH)的代謝產(chǎn)物.本文庫中也發(fā)現(xiàn)了幾個參與倍半萜合成及JH合成代謝的相關(guān)基因,這些基因可能參與了斑蝥素的合成.異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因,它能催化異戊烯醇焦磷酸(IPP)與二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)合成牻牛兒焦磷酸(GPP),IPP和GPP被催化生成法尼焦磷酸(FPP);FPP是合成倍半萜、法尼醇和JH 的前體物質(zhì),倍半萜又能參與昆蟲防御物質(zhì)及激素的合成[12].本實驗室已經(jīng)克隆到該基因的全長序列,在斑蝥素合成持續(xù)增長期內(nèi)(第5—25 天),該基因在雄蟲體內(nèi)的表達(dá)量也不斷升高并達(dá)到最大,而雌蟲的該基因在斑蝥素合成旺盛期(第22—25 天)的表達(dá)量極低,表明該基因在斑蝥素合成途徑中可能發(fā)揮重要作用[13].EST(JZ139216)編碼乙醇脫氫酶,它能氧化法尼醇和法尼醛.法尼醇轉(zhuǎn)化為法尼醛、法尼醛轉(zhuǎn)化為法尼酸是JH 合成途徑中的2 個關(guān)鍵反應(yīng)[14].EST(JZ139184)編碼細(xì)胞色素P450單氧酶,該酶不僅在昆蟲解毒中發(fā)揮重要作用,而且在一些昆蟲中細(xì)胞色素P450 單氧酶能使甲基法尼醇環(huán)氧化,有助于JH合成[15-16].同時,還有一個EST(JZ139186)編碼保幼激素酯酶(JHE),它參與JH 代謝,可以在昆蟲的不同時期調(diào)節(jié)JH 的水平[17].

    本研究不僅豐富了眼斑芫菁的遺傳信息,而且發(fā)現(xiàn)一些與斑蝥素合成的相關(guān)基因,這些基因可能在調(diào)控斑蝥素合成中發(fā)揮重要作用.本實驗室正在采用基因敲除、RNA 干擾[18]等技術(shù)對這些相關(guān)基因進(jìn)行功能驗證,為最終揭示斑蝥素的合成機(jī)理奠定基礎(chǔ).

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