朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物青貯過程中多酚及其功能活性的研究

戴倩倩 樊雨梅 張曉旭，2 倪元穎 馬麗艷*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083

2 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津300457）

朝鮮薊（Cynara scolymus L.）是菊科菜薊屬多年生草本植物，起源于地中海，具有保肝[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]等多種生理功能活性，在公元前四世紀(jì)就被用作食物和藥物[5]。朝鮮薊可食用部分為其花蕾，僅占植株的15%～20%，80%～85%部分為其莖葉副產(chǎn)物[6]。朝鮮薊莖葉同樣營養(yǎng)豐富，富含多酚、膳食纖維和菊糖，且資源巨大，常作為動(dòng)物飼料[7]，生產(chǎn)膳食纖維和提取多酚等天然抗氧化劑等原料[8-9]。由于其含水量在83.1%～90.1%[10]，極易腐敗，造成環(huán)境污染，因此急需解決貯藏問題。雖然熱風(fēng)干燥、冷藏等常規(guī)貯藏方式能夠滿足朝鮮薊莖葉加工的需要，但是綜合考慮經(jīng)濟(jì)可行性后認(rèn)為這些方法不適用于大量朝鮮薊廢棄物。

青貯是在厭氧條件下，通過附生于植物體的乳酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸（主要是乳酸），導(dǎo)致pH值降低，從而抑制各種腐敗微生物繁殖，達(dá)到保存青綠植物原料的儲(chǔ)藏方式[11]，常用于玉米秸稈、苜蓿等反芻動(dòng)物飼料的青綠保存[12-13]。目前，對(duì)朝鮮薊副產(chǎn)物青貯貯藏及其功能性影響的研究甚少，僅Meneses等[7，14]研究了朝鮮薊副產(chǎn)物青貯50 d后的營養(yǎng)品質(zhì)和感官特性。

因不良生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病等流行病的大量出現(xiàn)。目前全國約有3.82億的糖尿病患者，其中約90%患者屬于Ⅱ型糖尿病，Ⅱ型糖尿病患者的胰島素分泌缺陷、胰島素敏感性下降，使得患者血糖上升[15]。α-葡萄糖苷酶是血糖產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性來抑制血糖是治療糖尿病患者主要手段[16]。

本研究通過青貯處理朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物，探究青貯期間其營養(yǎng)成分、多酚的變化，并以抗氧化活性和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用來評(píng)價(jià)青貯對(duì)朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物功能活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝鮮薊（Cynara scolymus L.）的莖葉等副產(chǎn)物于2015年6月份采自于湖南省常德市西洞庭管理區(qū)（東經(jīng)111°69′，北緯29°05′），采收后立即送往實(shí)驗(yàn)室。

二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、三吡啶三嗪（TPTZ）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）、乳酸、沒食子酸，購自北京百靈威科技有限公司；α-葡糖苷酶、綠原酸、洋薊素、蘆丁、槲皮黃酮-3-O-葡糖苷酸、槲皮黃酮-3-O-葡萄糖苷、槲皮黃酮-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮黃酮、山奈素、山奈酚、木犀草素等標(biāo)準(zhǔn)樣品，購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200型液相色譜，美國Agilent公司；Agilent 6460型三重四級(jí)桿質(zhì)譜，美國Agilent公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；T6型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀，北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KSW-6-12型馬弗爐，北京科偉永興儀器公司；LGJ-12型冷凍干燥機(jī)，北京益德益華科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物青貯處理 將朝鮮薊莖葉切割成長約3～5 cm的小段，充分混合后，將小段植株裝于純尼龍復(fù)合PE材料包裝袋（28 cm×19 cm）中，真空密封包裝，（20±2）℃環(huán)境中貯存。分別在青貯0，10，20，30，50，70，90，120，150，180 d取樣，每次隨機(jī)抽取2袋，進(jìn)行冷凍干燥。隨后，粉碎凍干樣，過20目篩，裝于密封袋中，避光貯存于干燥器中。

1.3.2 朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物粗多酚提取 參照abu-reidah等[17]、Pandino等[18]方法。分別取朝鮮薊副產(chǎn)物青貯后凍干的樣品3 g，加30mL 70%甲醇，室溫震蕩提取1 h，冷凍離心15 min（4℃，3 800 r/min），取上清液。向沉淀中加入7.5mL 70%甲醇，重復(fù)上述提取操作，合并兩次上清液。40℃旋蒸除去甲醇，粗提物用凍干機(jī)冷凍干燥并稱重。隨后，加蒸餾水復(fù)溶，定容50mL得朝鮮薊副產(chǎn)物粗提液。以60℃熱風(fēng)干燥朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物樣品為對(duì)照。整個(gè)過程避光。

1.3.3 基本理化指標(biāo)的測(cè)定 根據(jù)AOAC的方法測(cè)定青貯期間的干物質(zhì)、總糖、灰分、粗脂肪、粗蛋白、粗纖維[19]。

1.3.4 青貯期間乳酸的測(cè)定 參考Jin等[20]的方法。按四分法取朝鮮薊副產(chǎn)物粉末400mg，加入20mL純凈水，超聲30min，4 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22μm水系濾膜，進(jìn)行HPLC分析。色譜柱：TechMate C18-ST（4.6mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸氫二銨緩沖液；等梯度洗脫，流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長210 nm。重復(fù)3次，外標(biāo)法定量。

1.3.5 總酚和單體酚含量及種類的測(cè)定 參考Yang等[21]的方法，利用福林酚法測(cè)定總酚含量，結(jié)果以沒食子酸含量mg GAE/g DM表示。

參考Jin等[22]方法，采用HPLC-QQQ-MS檢測(cè)單體酚，具體操作：取青貯和烘干后的粉末各1 g，加入25mL 90%甲醇，充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫提取1 h，提取液于40℃下旋蒸至干，加入5mL 90%甲醇復(fù)溶，過0.22μm尼龍濾膜，待分析。

色譜條件：色譜柱為Poroshell 120 EC-C18柱（3.0mm×50mm，2.7μm，美國Agilent公司），柱溫為25℃；流動(dòng)相為0.1%的甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相）。梯度洗脫條件：0～1min，5%B；1～3 min，5%～15%B；3～15min，15%～20%B。流速為0.3mL/min，進(jìn)樣量2μL。

質(zhì)譜采用ESI源，負(fù)離子模式，干燥氣溫度330℃，流速10 L/min，霧化氣壓35 psi，鞘氣溫度350℃，流速10 L/min，毛細(xì)血管電壓3 500 V，噴嘴電壓500 V。

1.3.6 抗氧化活性的測(cè)定 以DPPH[22]、ABTS[22]、FRAP[21]、Fe2+螯合[23]試驗(yàn)作為抗氧化活性測(cè)定指標(biāo)。

1.3.7 AG活性抑制 參考Jin等[21]的方法。取50μL朝鮮薊多酚提取液（0～0.6mg/mL）于96孔板中，加入100μLα-葡萄糖苷酶溶液（1.0U/mL，溶解于pH 6.9的1mol/L磷酸緩沖液），25℃孵 育10 min（100 r/min，10 min），加 入50μL PNPG溶液（5mmol/L，溶解于pH 6.9的0.1mol/L磷酸緩沖液），25℃孵育5min。在405 nm處測(cè)定吸光度。朝鮮薊多酚提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率（AG抑制率）的計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有樣品平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用Duncan’s test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05水平下進(jìn)行方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS（Version 21.0，美國芝加哥）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯期間朝鮮薊副產(chǎn)物中基本理化指標(biāo)的變化

從圖1可以看出，在青貯前期（30 d內(nèi)），除灰分指標(biāo)外，其它理化指標(biāo)變化較大，干物質(zhì)含量持續(xù)下降，結(jié)合乳酸含量的變化（圖2）說明在此期間乳酸菌大量繁殖產(chǎn)酸，消耗了總糖，帶動(dòng)了粗蛋白、粗脂肪的積累。上述營養(yǎng)物質(zhì)含量在青貯90 d后保持穩(wěn)定，青貯進(jìn)入穩(wěn)定期?？v觀青貯過程，180 d后，干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、灰分的含量與青貯前無顯著差異，粗纖維含量顯著上升（P＜0.05），而總糖含量顯著下降（P＜0.05）。

青貯過程中乳酸的積累至關(guān)重要，伴隨著乳酸菌發(fā)酵，乳酸含量在30 d內(nèi)持續(xù)增加（0.19%～1.97%），隨后其含量基本保持穩(wěn)定（圖2），說明乳酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸主要發(fā)生在青貯前期[7，14]。

2.2 青貯期間朝鮮薊副產(chǎn)物中總酚含量的變化

朝鮮薊副產(chǎn)物多酚含量在青貯90 d內(nèi)波動(dòng)較大（圖3），第30天達(dá)到高峰（P＜0.05），這與乳酸菌大量繁殖、代謝活躍有關(guān)，后者產(chǎn)生乳酸、降低pH值的同時(shí)，釋放糖苷酶等水解酶，具有促進(jìn)結(jié)合態(tài)多酚釋放的作用[24]。隨后總酚含量有所下降，這與朝鮮薊中多酚氧化酶的作用有關(guān)[25]。青貯后期，總酚含量保持穩(wěn)定。在180d青貯結(jié)束后，其總酚的保留率為96.2%。

圖1 朝鮮薊副產(chǎn)物青貯過程中營養(yǎng)成分的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，平行次數(shù)=3）Fig.1 Nutritional components content changes of artichoke by-product ensilage（Mean±SD，n=3）

圖2 青貯期間乳酸含量的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，平行次數(shù)=3）Fig.2 Changes of lactic acid content during silage（Mean±SD，n=3）

圖3 朝鮮薊副產(chǎn)物青貯過程中總酚含量的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.3 The changes of TPC in artichoke by-product for whole ensiling days（Mean±SD）

2.3 青貯前、后朝鮮薊副產(chǎn)物中單體酚的檢測(cè)

有研究表明，朝鮮薊的花蕾（可食部分）和葉中含有豐富的酚類物質(zhì)，以酚酸類中咖啡?？鼘幩嵫苌餅橹?，如綠原酸（5-O-咖啡?？鼘幩幔€包括一些類黃酮，如芹黃素和木犀草素糖苷等[1，26]。本文采用青貯方法實(shí)現(xiàn)朝鮮薊副產(chǎn)物的低能耗保存，并在青貯180 d后對(duì)朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物中最主要的單體酚（共20種）進(jìn)行分析（表1）。以熱風(fēng)干燥處理的樣品為對(duì)照，青貯后在朝鮮薊副產(chǎn)物中共檢測(cè)到11種咖啡?？鼘幩嵬之悩?gòu)體和7種黃酮類多酚，而在對(duì)照樣品中僅檢測(cè)到12種單體酚，包括7種咖啡酰奎寧酸同分異構(gòu)體和5種黃酮。從多酚組成與總量可以看出，與熱風(fēng)干燥工藝相比，青貯保藏對(duì)多酚更有利。在檢測(cè)到的20種多酚組分中，熱風(fēng)干燥樣品中單咖啡?？鼘幩犷惗喾拥膿p失最大，僅檢測(cè)到綠原酸。青貯后的副產(chǎn)物中咖啡酰奎寧酸含量遠(yuǎn)高于烘干處理，由于咖啡酰奎寧酸具有很強(qiáng)的抗氧化性[27]，因此青貯方式對(duì)活性成分的保存優(yōu)勢(shì)凸顯。此外，對(duì)比青貯和烘干后的朝鮮薊副產(chǎn)物中的黃酮類多酚發(fā)現(xiàn)，青貯樣品中蘆丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷含量非常高，烘干樣品中只有少量的蘆丁而不見山奈酚-3-O-葡萄糖苷。蘆丁是預(yù)防和治療血栓綜合癥的功能成分[28]。山奈酚-3-O-葡萄糖苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤的活性[29]。由此可見，青貯是保留朝鮮薊副產(chǎn)物中多酚類物質(zhì)的有效方法。

表1 青貯后朝鮮薊副產(chǎn)物中單體酚含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，平行次數(shù)=3）Table1 The content of the phenol from artichoke by-product after the ensilage（Mean±SD，n=3）

2.4 青貯對(duì)朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物抗氧化活性的影響

朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物中含有豐富的咖啡?？鼘幩岷忘S酮類活性物質(zhì)，它們都具有很強(qiáng)的抗氧化活性[3]。本研究對(duì)青貯朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物的抗氧化活性的保存能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，青貯180 d后，朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物仍能保持較好的ABTS自由基清除能力、鐵還原力和Fe2+螯合能力，DPPH活性略低于青貯前（P＜0.05）。值得關(guān)注的是，本研究中的朝鮮薊副產(chǎn)物表現(xiàn)出較強(qiáng)的鐵還原能力，青貯前、后其IC50值約為0.70μmol Fe2+/mg DM，遠(yuǎn)高于Kukic等[4]所報(bào)道的刺菜薊（Cynara cardunculus）的外苞片提取物的FRAP值，后者僅為0.12～0.38μmol Fe2+/mg DM。結(jié)論：朝鮮薊副產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且青貯有利于保持這種活性。

圖4 青貯期間朝鮮薊副產(chǎn)物的抗氧化活性（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，平行次數(shù)=3）Fig.4 Antioxidant activity of artichoke by-product in ensiling days（Mean±SD，n=3）

2.5 青貯對(duì)朝鮮薊副產(chǎn)物功能活性的影響

豐富的飲食使得器官對(duì)氧化損傷的敏感性增加，即餐后氧化應(yīng)激，它與糖尿病、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等高風(fēng)險(xiǎn)的慢性代謝疾病息息相關(guān)，而餐后氧化應(yīng)激直接與餐后血糖增加成正比[30]?？刂撇秃蟾哐呛脱趸瘧?yīng)激是控制糖尿病的實(shí)用治療方法。α-葡萄糖苷酶是高血糖形成的關(guān)鍵因子，可通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性來控制餐后高血糖和氧化應(yīng)激[31]。許多研究證明植物提取物如茶多酚等次生代謝產(chǎn)物可降低氧化水平，抑制α-葡萄糖苷酶的活性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青貯朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50為（0.18±0.06）mg/mL（圖5）。相比其它植物而言，Adefegha等[32]發(fā)現(xiàn)刺果番荔枝果實(shí)和種子提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分別為0.37mg/mL和0.37 mg/mL。Ademiluyi等[33]發(fā)現(xiàn)大豆單體酚和結(jié)合酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性IC50分別為0.37mg/mL和0.46mg/mL。本研究中的朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有顯著的優(yōu)勢(shì)。此外，由表2可見，青貯副產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與原料相比并未明顯改變（圖5）。而熱風(fēng)干燥貯藏后，原料中的單體酚損失極大（表1），降低了其抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力（P＜0.05），說明青貯可較好地保持朝鮮薊副產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

圖5 朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.5 Inhibition of artichoke by-product on α-glycosidase activity（Mean±SD，n=3）

3 結(jié)論

本研究探究了朝鮮薊副產(chǎn)物青貯過程中的營養(yǎng)成分、總酚及其單體酚種類和含量的變化，評(píng)價(jià)了青貯前、后抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性的變化，結(jié)果表明，青貯對(duì)營養(yǎng)成分及多酚有較好的保留作用，相比于原樣，總酚的保留率達(dá)96.2%。未處理的朝鮮薊副產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗氧化能力，青貯120 d后，其ABTS自由基清除能力、鐵還原能力和Fe2+螯合能力未見無明顯損失，而DPPH自由基清除能力略微下降。研究表明，無論青貯前、后，朝鮮薊副產(chǎn)物都可有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，說明青貯120 d能保持朝鮮薊副產(chǎn)物的酶抑制活性。綜上所述，朝鮮薊副產(chǎn)物中的多酚及其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶的活性在青貯后被高效保存，用青貯方式可長期貯藏。