培養(yǎng)溫度對(duì)腐敗希瓦氏菌DSM6067生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞膜理化特性的影響

楊勝平 章 縝 程 穎 錢韻芳 謝 晶*

（1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306

2 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 上海201306）

冷鏈流通是保持生鮮水產(chǎn)品品質(zhì)的重要手段，研究發(fā)現(xiàn)低溫冷藏并不能完全抑制微生物的生長(zhǎng)，部分能夠適應(yīng)低溫環(huán)境的腐敗微生物仍會(huì)生長(zhǎng)繁殖，并最終導(dǎo)致冷藏水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[1-3]，這已成為水產(chǎn)品冷鏈流通保鮮的主要限制因素。低溫冷藏條件對(duì)嗜熱菌、嗜中溫菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而對(duì)水產(chǎn)品中主要存在的耐冷菌（psychrotrophs）的抑制作用有限。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，耐冷菌在鯔魚[4]、凡納濱對(duì)蝦[5-6]、魷魚圈[7]、史氏鱘魚糜[8]等冷藏水產(chǎn)品微生物菌群中占主導(dǎo)地位。

在這些水產(chǎn)品耐冷菌中，以腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）最為典型。腐敗希瓦氏菌是冷藏凡納濱對(duì)蝦、帶魚的主要腐敗菌[2，9-10]，同時(shí)它也是牙鲆、大黃魚等大宗水產(chǎn)品的主要腐敗菌[11]。腐敗希瓦氏菌是一種革蘭氏陰性運(yùn)動(dòng)桿菌，具有較強(qiáng)的致腐敗能力，在其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)中不僅能夠分解肌肉蛋白，將氨基酸脫羧生成腐胺、尸胺等生物胺[12]，還可還原氧化三甲胺（TMAO）為三甲胺（TMA）[13]，產(chǎn)生H2S等臭味物質(zhì)[14]，其形成的生物被膜可導(dǎo)致水產(chǎn)品表面發(fā)粘[15]。腐敗希瓦氏菌是導(dǎo)致低溫貯藏水產(chǎn)品發(fā)生腐敗的重要因素之一。

腐敗希瓦氏菌具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力，不僅能在常溫下較快生長(zhǎng)，也能適應(yīng)低溫環(huán)境并保持一定生長(zhǎng)速率，因而成為水產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)菌。有研究表明，腐敗希瓦氏菌在新鮮水產(chǎn)品微生物菌群中的比例較小，在低溫貯藏過(guò)程中才迅速增長(zhǎng)，如新鮮凡納濱對(duì)蝦中腐敗希瓦氏菌的數(shù)量?jī)H占微生物菌落總數(shù)的1.6%，而4℃貯藏10 d后就增加到約24.7%[2]。在低溫貯藏的草魚片[12]、大西洋馬鮫魚[16]、牡蠣[17]等水產(chǎn)品中亦有類似發(fā)現(xiàn)。如何抑制低溫下腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)成為水產(chǎn)品冷藏保鮮中亟待解決的問(wèn)題。

低溫脅迫下腐敗希瓦氏菌適冷調(diào)控機(jī)制對(duì)其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)起著至關(guān)重要的作用，在適冷過(guò)程中，微生物細(xì)胞膜流動(dòng)性的維持是其在低溫環(huán)境下進(jìn)行正常代謝的關(guān)鍵因素[18]，而流動(dòng)性的維持主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中脂肪酸組成，降低膜脂熔點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般認(rèn)為常見(jiàn)的調(diào)節(jié)方式包括：①增加不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）含量；②縮短脂肪酸?；湹拈L(zhǎng)度；③增加支鏈脂肪酸和異構(gòu)分支脂肪酸的比例；④減少環(huán)狀脂肪酸的含量[19]。其中，以脂肪酸不飽和度的調(diào)節(jié)最為關(guān)鍵，該調(diào)控通路可作為抑菌的靶標(biāo)[20]。

目前，有關(guān)腐敗希瓦氏菌對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸含量調(diào)節(jié)機(jī)制的報(bào)道較少。本文以水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗希瓦氏菌的模式菌株DSM6067為對(duì)象，研究不同培養(yǎng)溫度條件下的腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、細(xì)胞膜脂肪酸組成、膜蛋白含量、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜流動(dòng)性變化，分析溫度對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其細(xì)胞膜理化特性的影響，以期為通過(guò)表征細(xì)胞蛋白質(zhì)組差異表達(dá)，推測(cè)溫度敏感因子和不飽和脂肪酸代謝通路；通過(guò)研究不飽和脂肪酸代謝通路中去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄量以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子含量與溫度的關(guān)系，探討腐敗希瓦氏菌在適冷過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)理。對(duì)于進(jìn)一步研究抑制冷鏈流通中腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)，保障水產(chǎn)品品質(zhì)的方法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 腐敗希瓦氏菌模式菌株 腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM 6067，德國(guó)Leibniz-Institut DSMZ GmbH微生物研究所。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：腦心浸肉湯（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）等微生物培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS），sigma公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；12%電泳預(yù)制膠、電泳緩沖液，南京建成生物有限公司；雙色預(yù)染蛋白Marker、蛋白Loading Buffer、C510041高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。甲醇、正己烷、氯仿、十九烷酸甲酯、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要設(shè)備與儀器：LDZX-50KBS蒸汽滅菌器，上海申安公司；VS-1300L-U潔凈工作臺(tái)，蘇州蘇凈泰安集團(tuán)；Eppendorf 5427R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；H-2050R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；Ymnl-150型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；SHA-2型制冷恒溫振蕩器，金壇市城西崢嶸實(shí)驗(yàn)儀器廠；JEM-1200EX透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；RF-6000熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；Trace 1310 ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，ThermoFisher公司；iMark酶標(biāo)儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀、小型Trans-Blot垂直電泳槽，美國(guó)Bio-Red伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM 6067菌粉溶解于已滅菌的BHI培養(yǎng)基中，于30℃下活化培養(yǎng)12~18 h至菌液濃度達(dá)到108CFU/mL。取適量菌液接種于已滅菌的TSB培養(yǎng)基中再次活化，待用。

1.2.2 微生物生長(zhǎng)曲線繪制及腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的選取 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的繪制：吸取0.1mL活化培養(yǎng)至108CFU/mL的TSB菌液于裝有100 mL新滅菌的TSB培養(yǎng)液的三角瓶中，分別在30，10℃和4℃下培養(yǎng)，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定菌液的OD值，根據(jù)OD595值繪制生長(zhǎng)曲線。

腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的選?。簠⒄崭爹i等[21]及Zwietering等[22]修正的Gompertz方程描述的腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)方法。

1.2.3 細(xì)菌脂肪酸組成及含量的測(cè)定 參照Diomandé等[23]的方法并略有修改。將細(xì)菌培養(yǎng)至各溫度下對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD595值約為0.6），將菌液5 000 g離心，沉淀經(jīng)PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗3次，收集菌體。菌體經(jīng)液氮猝滅，于-80℃隔夜凍藏，次日冷凍干燥成菌粉。取80~100 mg凍干菌粉加入15mL離心管中，繼續(xù)加入2mL 5%鹽酸甲醇溶液，3mL體積比為1∶1的氯仿-甲醇溶液，100μL十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)。在85℃水浴鍋中水浴1 h后降至室溫，在離心管中加入1mL正己烷，震蕩萃取2min，靜置1 h，待分層。取上層清液100μL，用正己烷定容1mL，0.45μm濾膜過(guò)膜后上機(jī)分析。

色譜條件：色譜柱：TG-5MS（30m×0.25mm×0.25μm），升溫程序：80℃保持1min，以10℃/min的速率升至200℃，繼續(xù)以5℃/min的速率升至250℃，最后以2℃/min的速率升到270℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度：290℃，載氣流速：1.2mL/min，不分流進(jìn)樣，開(kāi)閥時(shí)間1min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：280℃，傳輸線溫度：280℃，溶劑延遲時(shí)間：5.00min，掃描范圍：30~400 amu，離子源：EI源70 eV。

1.2.4 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳與膜蛋白含量的測(cè)定 將30，10℃和4℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD595值約為0.6）的細(xì)菌菌液于5 000 g下離心，沉淀經(jīng)PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗3次后收集菌體。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）參照雷雨婷等[24]的方法進(jìn)行。樣品經(jīng)丙酮洗滌后，加入適量loading buffer煮沸5min，冷卻后加樣于1mm厚的凝膠孔道中，上樣量5μL。膜蛋白含量參照Dong等[25]的方法，使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。

1.2.5 透射電子顯微鏡（TEM）觀察細(xì)菌微觀結(jié)構(gòu)變化 將不同溫度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌株離心，收集菌體并用0.2mol/L磷酸緩沖液稍清洗，加入2.5%的戊二醛固定液（勿沖散菌體），4℃下固定過(guò)夜，切片，透射電子顯微鏡觀察并拍照[26]。

1.2.6 細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定 根據(jù)康亦兼等[27]的方法進(jìn)行，略有修改。將活化好的菌種分別接種至100mL新滅菌的TSB培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)8 h，此后將其轉(zhuǎn)移，置4℃環(huán)境下適冷培養(yǎng)。分別在30℃培養(yǎng)8 h，4℃培養(yǎng)24，72，144 h及216 h取菌樣，4℃下5 000 g離心10min，收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液清洗3次，重懸于含0.5mmol/L DTT和0.1%TWEEN 20的PBS緩沖液中。將菌液于冰浴下超聲細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎6min，之后將其在4℃下10 000 g離心20min，棄沉淀，測(cè)定上清液中蛋白濃度并保存于-40℃下待用。用Tris-Hcl緩沖液配制5mmol/L ANS母液，臨用前將其稀釋至1.0×10-4mol/L。膜蛋白終質(zhì)量濃度為5mg/L，ANS終質(zhì)量濃度為10μmol/L，于室溫孵育20 min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)385 nm、發(fā)射波長(zhǎng)480 nm條件下測(cè)定。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Shewanella putrefaciens at different temperatures

表1 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 The growth parameters of Shewanella putrefaciens at different temperatures

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌在30，10℃及4℃條件下的生長(zhǎng)情況

腐敗希瓦氏菌模式菌株在30，10℃和4℃下的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)采用修正的Gompertz方程描述，在細(xì)菌生長(zhǎng)期間OD595值擬合曲線如圖1所示。通過(guò)Compertz方程擬合所得腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

Compertz方程擬合的30，10℃及4℃培養(yǎng)下的生長(zhǎng)曲線相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9949，0.9971和0.9859，具有較高的擬合度，能夠較好地反映細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。由生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知腐敗希瓦氏菌在30，10℃及4℃下生長(zhǎng)的延滯時(shí)間分別為3.35，25.94 h和122.03 h，隨著培養(yǎng)溫度的下降，細(xì)菌的延滯時(shí)間延長(zhǎng)。腐敗希瓦氏菌在3種培養(yǎng)溫度下的最大比生長(zhǎng)速率μmax：0.047 h-1（10℃），其與30℃下的0.081 h-1相比下降較明顯，而在4℃時(shí)的μmax僅為0.017 h-1?？梢?jiàn)，培養(yǎng)溫度越低，微生物的增長(zhǎng)越緩慢。30℃是腐敗希瓦氏菌的最適生長(zhǎng)溫度，細(xì)菌迅速增長(zhǎng)繁殖，經(jīng)短暫的延滯期后快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在8 h左右達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，并在24 h后基本趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)溫度10℃下，希瓦氏菌經(jīng)40 h培養(yǎng)后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。培養(yǎng)溫度4℃下的細(xì)菌增長(zhǎng)速度較慢，腐敗希瓦氏菌在前122 h均在延滯期，168 h后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。由腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌DSM6067的增長(zhǎng)雖然隨培養(yǎng)溫度的下降而減緩，但是仍能適應(yīng)低溫環(huán)境生長(zhǎng)。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜脂肪酸GC-MS圖譜Fig.2 GC-MS of fatty acids in Shewanella putrefaciens cell membrane at different temperatures

2.2 30，10℃及4℃條件下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜脂肪酸組成含量變化

微生物為了適應(yīng)低溫環(huán)境，細(xì)胞膜脂肪酸組成會(huì)發(fā)生一定變化[28]。以C8：0（辛酸）、C24：1（神經(jīng)酸）等共35種脂肪酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，分析30，10℃和4℃不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏模式菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞膜中脂肪酸情況，最終檢出13種脂肪酸。脂肪酸GC-MS圖譜及檢出的脂肪酸相對(duì)含量見(jiàn)圖2和圖3。從圖3可知，腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜脂肪酸以C16：0（棕櫚酸）、C16：1（棕櫚油酸）和C18：0（硬脂酸）為主。隨著培養(yǎng)溫度的下降，腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜中的C15：0、C16：0、C17：0、C17：1、C18：0、C18：1N9C和C18：1N9T含量均下降，而C12：0、C14：0及C16：1含量則上升較為明顯。其中4℃與30℃培養(yǎng)下細(xì)菌相比C16：1含量上升最為顯著，該現(xiàn)象與竇京嬌等[29]對(duì)北極海冰細(xì)菌在低溫脅迫下脂肪酸的變化研究結(jié)果相一致。由此說(shuō)明單不飽和脂肪酸C16：1在維持細(xì)胞膜流動(dòng)性方面可能起關(guān)鍵性作用。

圖3 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜脂肪酸相對(duì)含量變化Fig.3 The changes of membrane fatty acids in Shewanella putrefaciens at different temperatures

2.3 30，10℃及4℃條件下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜蛋白含量的變化

腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳圖譜如圖4所示。隨著培養(yǎng)溫度的下降，腐敗希瓦氏菌膜蛋白種類有所增加，其中低溫培養(yǎng)下以分子質(zhì)量在30 ku及60~120 ku間的蛋白表達(dá)量較多。Bisht S C等[30]有關(guān)嗜冷菌的研究表明，細(xì)菌在低溫下產(chǎn)生的分子質(zhì)量為30 ku的蛋白一般為冷激蛋白。圖5顯示腐敗希瓦氏菌膜蛋白濃度情況。細(xì)菌膜蛋白濃度也隨著培養(yǎng)溫度的降低而上升?？梢?jiàn)，腐敗希瓦氏菌為了適應(yīng)低溫環(huán)境，其細(xì)胞膜蛋白表達(dá)種類和含量均有上升。對(duì)于不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌所表達(dá)的差異蛋白種類還有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of membrane proteins in Shewanella putrefaciens at different temperatures

圖5 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜蛋白含量變化Fig.5 The changes of membrane proteins in Shewanella putrefaciens at different temperatures

2.4 30，10℃及4℃條件下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞微觀形態(tài)變化

透射電子顯微鏡（TEM）觀察腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067的細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)如圖6所示。在30℃培養(yǎng)時(shí)，腐敗希瓦氏菌的細(xì)胞壁膜呈現(xiàn)波浪狀褶皺，可能是因?yàn)楦瘮∠Ｍ呤暇淖钸m生長(zhǎng)溫度為30℃，細(xì)胞壁膜出現(xiàn)的褶皺使其表面積增大，使細(xì)胞有利于代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隨著培養(yǎng)溫度的降低，腐敗希瓦氏菌細(xì)胞壁膜變得較為平滑，其表面積相對(duì)較小，從而影響其胞內(nèi)外物質(zhì)交換，細(xì)胞代謝增長(zhǎng)速率下降。此外，透射電子顯微鏡下的腐敗希瓦氏菌部分細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空泡，可能與細(xì)胞內(nèi)容物外漏有關(guān)，此現(xiàn)象與蔡瑾[31]用TEM觀察細(xì)菌的結(jié)果類似。與10℃和4℃低溫培養(yǎng)下的細(xì)菌相比，30℃培養(yǎng)下的腐敗希瓦氏菌出現(xiàn)的空泡較多，可能是由于培養(yǎng)溫度較高，細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性較強(qiáng)，在TEM樣品前處理時(shí)易導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，細(xì)胞內(nèi)容物流出形成空泡。

圖6 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞TEM顯微結(jié)構(gòu)變化Fig.6 The microscopic structure of Shewanella putrefaciens at different temperatures by TEM

2.5 腐敗希瓦氏菌在冷適應(yīng)過(guò)程中細(xì)胞膜流動(dòng)性變化

8-苯胺-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）是一種熒光染料，其常作為一種蛋白質(zhì)熒光探測(cè)劑，較適用于標(biāo)記測(cè)定親和力疏水性配體及其相應(yīng)的結(jié)合蛋白，如具有疏水性游離脂肪酸的脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）。ANS的熒光強(qiáng)度值與細(xì)胞膜的流動(dòng)性呈反比，即熒光強(qiáng)度越高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性越低[29]。本文采用ANS熒光探針?lè)ㄑ芯考?xì)胞膜流動(dòng)性，不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜流動(dòng)性如圖7所示。腐敗希瓦氏菌在波長(zhǎng)485 nm處出現(xiàn)熒光強(qiáng)度峰值，細(xì)菌在30℃培養(yǎng)8 h，熒光強(qiáng)度值較低，說(shuō)明細(xì)胞膜流動(dòng)性較好。將其轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著降低?？梢?jiàn)，腐敗希瓦氏菌在低溫脅迫下細(xì)胞膜流動(dòng)性下降。隨著4℃低溫環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，希瓦氏菌的細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，表明腐敗希瓦氏菌逐漸適應(yīng)了低溫環(huán)境。

圖7 腐敗希瓦氏菌適冷過(guò)程中細(xì)胞膜流動(dòng)性變化Fig.7 The changes in membrane fluidity of Shewanella putrefaciens during cold adaptation process

3 結(jié)論

對(duì)不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM067生長(zhǎng)情況及細(xì)胞膜理化特性的研究表明，腐敗希瓦氏菌在低溫脅迫下生長(zhǎng)速率下降，細(xì)胞膜理化特性發(fā)生一定的變化。腐敗希瓦氏菌模式菌株在30℃培養(yǎng)下經(jīng)3.35 h延滯期后即進(jìn)入快速增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而10℃下延滯期為25.94 h，4℃培養(yǎng)下細(xì)菌經(jīng)122.03 h才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；腐敗希瓦氏菌最大比生長(zhǎng)速率表明，4℃下μmax為0.017 h-1，顯著低于30℃培養(yǎng)下的0.081 h-1。培養(yǎng)溫度越低細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖越緩慢。腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜脂肪酸組成以C16：0、C16：1和C18：0為主，隨著培養(yǎng)溫度的下降，單不飽和脂肪酸C16：1含量上升，其含量由30℃的26.62%升至4℃培養(yǎng)的46.66%。C16：1在腐敗希瓦氏菌適冷過(guò)程中維持細(xì)胞膜流動(dòng)性方面起關(guān)鍵性作用。不同培養(yǎng)溫度下的腐敗希瓦氏菌膜蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)差異，隨著培養(yǎng)溫度的降低，分子質(zhì)量在30 ku及60~120 ku間的細(xì)菌蛋白表達(dá)量增多。腐敗希瓦氏菌細(xì)胞TEM顯微結(jié)構(gòu)顯示：30℃培養(yǎng)下的細(xì)菌細(xì)胞壁膜呈現(xiàn)波浪狀褶皺，細(xì)胞膜表面積大，而培養(yǎng)溫度下降，細(xì)胞壁膜較為平滑。細(xì)胞中出現(xiàn)的空泡從一定程度上反映細(xì)胞膜的流動(dòng)性，30℃最適培養(yǎng)溫度下細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性較好。對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的研究發(fā)現(xiàn)，腐敗希瓦氏菌從最適的30℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)入4℃培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)菌的膜流動(dòng)性明顯下降，然而經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的適冷，細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性得到一定的恢復(fù)，表明腐敗希瓦氏菌經(jīng)自身理化特性的變化逐漸適應(yīng)了低溫環(huán)境，從而能夠繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。