慶大霉素適應(yīng)性菌株遺傳穩(wěn)定性研究

郭慧玲 盧 潔 張文羿 張和平 孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室奶制品加工農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

益生菌包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和革蘭氏陽性球菌[1]。大量研究表明，它可以調(diào)節(jié)人體腸道菌群[2]，增強(qiáng)免疫力[3]，預(yù)防或改善腹瀉[4]和乳糖不耐癥等醫(yī)療保健作用[5-6]。乳酸菌被認(rèn)為是安全性菌株，廣泛用于發(fā)酵食品中。乳酸菌使用前必須經(jīng)過嚴(yán)格的篩選，除了需要具有較好的發(fā)酵特性外，還需具備優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性。歐盟食品科學(xué)委員會(huì)（SCFEC）指出“在嬰幼兒食品中使用的益生菌必須經(jīng)過表型和基因型雙重驗(yàn)證才可以使用”[7]。更有研究者認(rèn)為只有在1年連續(xù)培養(yǎng)過程中，表型和基因型都沒有發(fā)生變化的益生菌才被認(rèn)為具有穩(wěn)定性[8]。從20世紀(jì)開始，隨著抗生素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的大量使用，它對(duì)人類健康產(chǎn)生了巨大的影響[9]。到20世紀(jì)中葉，抗生素被卷入細(xì)菌耐藥性和光譜耐藥性的問題中，在致病菌[10]和益生菌[11]中都有報(bào)道存在耐藥性。益生菌的安全性問題成為了人們首要關(guān)心的問題。

微生物適應(yīng)性進(jìn)化是對(duì)生物進(jìn)化研究的一項(xiàng)新技術(shù)，它被稱為“定向進(jìn)化、實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化或馴化”[12]。微生物適應(yīng)性進(jìn)化使菌株在較短的時(shí)間內(nèi)改變某些表型或生理特性（如菌體生長速度、底物消耗速度、耐高溫等），并且基本不會(huì)影響菌株的其他優(yōu)良性狀[13]。該技術(shù)被廣泛用于優(yōu)良菌株的選育。目前國內(nèi)外關(guān)于致病菌的微生物進(jìn)化研究較多，對(duì)于乳酸菌的進(jìn)化研究也逐漸增多。其中，Lenski等[14]將12株大腸桿菌在限制性培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)化20年，近50 000代，采用基因組重測(cè)序的方法分析其穩(wěn)定性。Gregory等[15]研究了40株釀酒酵母菌，分別連續(xù)進(jìn)化1 000代，采用基因組重測(cè)序技術(shù)分析突變位點(diǎn)，結(jié)果顯示，在連續(xù)培養(yǎng)過程中，酵母菌發(fā)生的突變位點(diǎn)可以一直保持下去。Bas等[16]在限制性培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)植物乳桿菌WCFS1，通過基因組重測(cè)序技術(shù)分析該菌株在長期進(jìn)化過程中是否發(fā)生選擇性突變。

基于上述理論，本課題組將干酪乳桿菌Zhang在抗生素環(huán)境下進(jìn)行10個(gè)月的適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)。分別對(duì)其耐藥表型和基因型進(jìn)行監(jiān)測(cè)，研究結(jié)果顯示，干酪乳桿菌Zhang在1 200代時(shí)對(duì)慶大霉素的最小抑制濃度達(dá)到最大值32μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)后最小抑制濃度沒有發(fā)生變化。基因組的突變率在1 200代后基本保持不變[17]。同時(shí)有研究者報(bào)道，由于點(diǎn)突變引起的耐藥性變化，其耐藥性不發(fā)生轉(zhuǎn)移[18]。作者認(rèn)為得到的慶大霉素適應(yīng)性1 200代干酪乳桿菌是安全性菌株。為了進(jìn)一步分析慶大霉素適應(yīng)性1 200代菌株的遺傳穩(wěn)定性和安全性，本研究采用連續(xù)傳代培養(yǎng)的方法，將其在去慶大霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng)1 000代后，結(jié)合表型和基因型分析其遺傳穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

選取的菌株為在慶大霉素環(huán)境中連續(xù)傳代培養(yǎng)1 200代的干酪乳桿菌Zhang[17]，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。MRS Broth（CM0359）和ISO-SENSITEST Broth（CM0473），OXOID公司；LSM（90%MRS和10%IST）、慶大霉素，英國Sigma公司。

主要設(shè)備與儀器：無菌工作臺(tái)（NSC-IIA-1200），日本；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（HA-300M），HIRAYAMA；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-500F），上海一恒科技有限公司；紫外-可見光分光光度計(jì)（ND-1000），美國NanoDrop公司；梯度PCR擴(kuò)增儀，Applied Biosystems；Hiseq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的傳代培養(yǎng)和保藏 將在慶大霉素中進(jìn)化1 200代的干酪乳桿菌Zhang的3個(gè)平行菌株分別作為本試驗(yàn)的出發(fā)菌株，編號(hào)為Q-G-0-Zhang-1，Q-G-0-Zhang-2，Q-G-0-Zhang-3。每24 h以1%的接種量傳入LSM培養(yǎng)基中[19]，共傳1 000代。每傳200代，分別對(duì)3株菌進(jìn)行保藏（甘油保藏和凍干菌粉保藏）。

1.2.2 傳代菌株生長曲線的測(cè)定和生長代數(shù)的計(jì)算 將3株0代菌株分別活化后，以1%的接種量接入空白的LSM培養(yǎng)基中，測(cè)定生長曲線。每2 h測(cè)定活菌數(shù)，在波長600 nm處的吸光值和pH值。通過生長曲線確定3株菌的生長規(guī)律，計(jì)算生長代數(shù)。生長代數(shù)=log2（Nf/N0），式中Nf是菌株進(jìn)入穩(wěn)定期活菌數(shù)，N0是初始接種菌株的活菌數(shù)[17]。

1.2.3 傳代菌株的純度檢測(cè) 每200代對(duì)3株菌進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌體形態(tài)的變化。同時(shí)提取細(xì)菌DNA，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（QIAGEN），具體方法參照試劑盒使用說明書。使用提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，退火溫度58℃，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 傳代過程中的指標(biāo)檢測(cè) 每200代分別測(cè)定菌株在培養(yǎng)周期末的活菌數(shù)變化，在波長600 nm處的濁度變化以及對(duì)慶大霉素的耐藥性變化。對(duì)慶大霉素的耐藥性檢測(cè)采用肉湯稀釋法[20-21]。首先將傳代菌株在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于5mL生理鹽水中，至OD600在0.16～0.2之間，將其稀釋500倍加入空白LSM培養(yǎng)基中，然后準(zhǔn)確稱取抗生素，配制不同濃度梯度的抗生素溶液，最后將抗生素溶液與菌液混合，48 h后讀取MIC值。

1.2.5 傳代菌株的全基因組重測(cè)序 將菌株QG-1000-Zhang-1活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，離心后用生理鹽水洗菌3次，棄上清，液氮速凍，真空冷凍干燥，將凍干菌粉送往上海美吉生物有限公司，對(duì)樣品進(jìn)行基因組重測(cè)序。提取細(xì)菌基因組DNA，將高質(zhì)量初始量為3μg的DNA使用高壓氮?dú)獯驍喑?00～300 bp的片段，采用T4聚合酶和3’-5’核酸外切酶進(jìn)行雙末端修復(fù)，然后將A堿基引入3’端，使DNA片段可以互補(bǔ)連接，純化DNA片段并對(duì)DNA片段進(jìn)行富集，最后對(duì)文庫進(jìn)行定量與驗(yàn)證，合格后采用Illumina的Hiseq2000高通量測(cè)序平臺(tái)。

1.2.6 重測(cè)序數(shù)據(jù)處理 采用CLC Genomic Workbench V8.5.1分析基因組重測(cè)序的數(shù)據(jù)。對(duì)檢測(cè)出的非同義突變位點(diǎn)所在基因的氨基酸序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析突變位點(diǎn)所在基因的功能和注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 0代菌株生長曲線和代數(shù)計(jì)算

圖1為Q-G-0-Zhang-1的生長曲線。測(cè)定的活菌數(shù)、濁度和pH值可以反映慶大霉素適應(yīng)性菌株的生長規(guī)律。通過該菌株在一個(gè)生長周期的生長規(guī)律，計(jì)算生長代數(shù)。Q-G-0-Zhang-1在一個(gè)生長周期內(nèi)是6.65代。

2.2 傳代菌株純度檢測(cè)

2.2.1 16S rRNA序列分析 對(duì)16S rRNA序列測(cè)序，利用NCBI的比對(duì)功能，對(duì)所傳菌株的物種進(jìn)行鑒定。

以600代菌株為例，結(jié)果見圖2。600代菌株檢測(cè)結(jié)果顯示為干酪乳桿菌。

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)的觀察 圖3所示0代干酪乳桿菌Zhang和1 000代干酪乳桿菌Zhang在顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)，可以看出，細(xì)胞形態(tài)都為短桿狀，單個(gè)或鏈狀。1 000代與0代細(xì)胞形態(tài)差別不明顯，基本一致，說明在去選擇壓力后連續(xù)進(jìn)化1 000代后，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生變化，較穩(wěn)定。

圖1 Q-G-1000-Zhang-1的生長曲線Fig.1 Grow curve of Q-G-1000-Zhang-1

圖2 Q-G-600-Zhang-1的NCBI比對(duì)結(jié)果Fig.2 Results of blast in NCBI

圖3 傳代菌株細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cell appearance of different generations

2.3 傳代菌株的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 活菌數(shù) 圖4顯示干酪乳桿菌Zhang在去慶大霉素環(huán)境中傳代培養(yǎng)1 000代期間活菌數(shù)的變化情況。可以看出，200代生長周期末的活菌數(shù)比0代活菌數(shù)高，可能是由于在去抗生素的環(huán)境中，菌株的活菌數(shù)升高，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，活菌數(shù)雖有些變化，但幾乎趨于平穩(wěn)，總數(shù)差異不明顯。

2.3.2 濁度 圖5顯示傳代菌株在0～1 000代期間OD值的變化情況。由圖5可看出，在200代時(shí)OD值明顯升高，隨后在傳代的過程中幾乎趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，與活菌數(shù)的變化趨勢(shì)一致。

圖4 傳代菌株活菌數(shù)變化Fig.4 Viable counts change of different generations

圖5 傳代菌株OD值變化Fig.5 OD changes of different generations

2.3.3 耐藥性 表1顯示菌株在去慶大霉素環(huán)境中連續(xù)傳代培養(yǎng)1 000代期間，對(duì)慶大霉素的耐藥性的變化情況?？梢钥闯?，菌株對(duì)慶大霉素的耐藥性保持穩(wěn)定狀態(tài)，沒有恢復(fù)到原始干酪乳桿菌Zhang對(duì)慶大霉素的MIC值。

表1 傳代過程中菌株對(duì)慶大霉素的耐藥性變化Table1 Changes in resistance to gentamicin of different generations

2.4 傳代菌株基因組分析

2.4.1 高通量測(cè)序質(zhì)量控制 圖6顯示測(cè)序結(jié)果中，長度為150～151 bp的序列數(shù)達(dá)到100%，其余長度的序列為0。PHRED值反映序列中堿基的錯(cuò)誤率。PHRED值越大，堿基錯(cuò)誤率越低。由圖7可知，本研究中PHRED值在12～42之間，其中PHRED值大于20的序列占總序列的99.04%。當(dāng)PHRED值為最大（42）時(shí)，對(duì)應(yīng)的序列數(shù)為1 512 187，占比23.25%。最大占比為25.66%，對(duì)應(yīng)序列數(shù)為1 668 984，PHRED值為41。圖8為不同堿基位置的質(zhì)量得分。所測(cè)序列不同堿基位置的PHRED值均大于30。不同位置堿基的質(zhì)量較高，可進(jìn)行下一步分析。

2.4.2 序列的修整 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，低質(zhì)量的序列與基因組參考序列匹配時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配現(xiàn)象，在進(jìn)行序列組裝和匹配前，要對(duì)低質(zhì)量序列進(jìn)行修整。（根據(jù)序列質(zhì)量評(píng)分進(jìn)行修整）。表2是對(duì)菌株Q-G-1000-Zhang-1進(jìn)行修整的結(jié)果。修整后序列的長度變?yōu)?47.5 kb，序列數(shù)為6 478 514，修整率為0.41%。

表3是測(cè)序序列與參考序列的匹配結(jié)果，本研究將匹配序列長度比例設(shè)為0.5，就是至少有50%的匹配序列與參考序列相匹配，該序列才可以保留。也可以通過修改匹配序列長度比例值來提高匹配質(zhì)量。本研究有98.53%的序列匹配到參考序列上，可與參考序列比對(duì)。

圖6 測(cè)序結(jié)果序列長度分布圖Fig.6 Distribution of sequence lengths

圖7 不同PHRED值對(duì)應(yīng)的序列數(shù)Fig.7 Distribution of the number of sequences corresponding to different PHRED values

圖8 不同堿基位置對(duì)應(yīng)的PHRED值Fig.8 Distribution of PHRED values at different base positions

表2 Q-G-1000-Zhang-1測(cè)序序列修整結(jié)果Table2 Detailed trimresults of Q-G-1000-Zhang-1

表3 Q-G-1000-Zhang-1測(cè)序序列匹配結(jié)果Table3 Mapping results of Q-G-1000-Zhang-1

2.4.3 基因組中基因突變檢測(cè)結(jié)果 采用CLC Genomics Workbench 7.5軟件對(duì)基因組測(cè)序結(jié)果中的基因突變類型進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到11個(gè)突變位點(diǎn)，其中4個(gè)同義突變和7處非同義突變。由于非同義突變一般可能引起功能基因的改變，因此只對(duì)7處非同義突變位點(diǎn)進(jìn)行分析。7處非同義位點(diǎn)如表4和圖9所示。所有突變位點(diǎn)都不在同一個(gè)基因上。干酪乳桿菌Zhang上有一個(gè)36 kb大小的質(zhì)粒，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有突變位點(diǎn)不在質(zhì)粒上。其中突變基因LCAZH_1039編碼甘油二酯激酶參與脂質(zhì)代謝（甘油酯代謝、甘油磷脂代謝）和次生代謝產(chǎn)物的合成。LCAZH_1154參與氧化磷酸化代謝。LCAZH_2480編碼RNA聚合酶分別參與嘌呤代謝和嘧啶代謝。參與陽離子抗微生物肽的抑制作用的LCAZH_2238編碼賴氨酰轉(zhuǎn)移酶。賴氨酰轉(zhuǎn)移酶催化L-[14 C]-O-賴氨酰，最終形成磷脂酰甘油。

表4 Q-G-1000-Zhang-1非同義突變位點(diǎn)分布Table4 Identified Non-synonymous of Q-G-1000-Zhang-1

圖9 Q-G-1000-Zhang-1突變位點(diǎn)分布圖Table9 Distribution of gene mution in Q-G-1000-Zhang-1

3 討論

微生物在受到外界環(huán)境或其它一些刺激后，會(huì)自發(fā)地產(chǎn)生自我保護(hù)機(jī)制，使其迅速地適應(yīng)環(huán)境。益生菌也具有該特性。益生菌在人體發(fā)揮益生作用，必須能夠活著經(jīng)過胃（高酸環(huán)境）和小腸（膽鹽環(huán)境），到達(dá)大腸并定植。對(duì)乳酸菌耐酸和耐膽鹽脅迫的應(yīng)激機(jī)理進(jìn)行研究，可以提高乳酸菌在人體消化道的存活率，從而促使它發(fā)揮更好的益生功能。Munoz等[22]報(bào)道，先把戊糖乳桿菌MP-10培養(yǎng)在含有亞致死濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫處理，對(duì)得到的耐藥性菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果顯示幾種基因發(fā)生差異表達(dá)，菌株可以較好地適應(yīng)各種環(huán)境，包括胃、腸道條件。

近年來，研究者對(duì)于益生菌和抗生素聯(lián)合用于腸道疾病的治療產(chǎn)生越來越濃厚的興趣，在臨床上取得一定的療效。Kotowaka等[23]報(bào)道布拉酵母菌對(duì)兒童抗生素相關(guān)性腹瀉的影響，采用雙盲隨機(jī)安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，共269名兒童，其中132名兒童接受抗生素治療并添加250mg布拉酵母菌凍干菌粉，137名兒童為安慰劑對(duì)照組，結(jié)果顯示，益生菌組減少了患抗生素相關(guān)性腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)。該組兒童沒有任何不良反應(yīng)。由于抗生素成為益生菌新的環(huán)境脅迫，因此有必要對(duì)益生菌在抗生素環(huán)境下的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制以及菌株的安全性進(jìn)行全面分析。

本研究將具有耐藥性的干酪乳桿菌Zhang在去選擇壓力連續(xù)傳代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)耐藥表型和基因組高度穩(wěn)定，雖然發(fā)生幾處點(diǎn)突變，但是對(duì)其耐藥性沒有影響。該菌株進(jìn)一步被確認(rèn)為安全性菌株。本研究結(jié)果為該菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論參考。