多糖中金屬離子對其抗氧化活性及抗腫瘤活性的影響

錢怡霖 汪東風(fēng) 范明昊 孫瀟雯 李 昕

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266003）

多糖是廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中的由相同或不同的單糖構(gòu)成的高分子化合物，是所有生命有機(jī)體的重要組成成分與維持生命所必需的結(jié)構(gòu)材料[1]。由于多糖具有多種生物活性和無毒副作用，使其生物資源的研究、開發(fā)和利用日益活躍，在保健食品及醫(yī)療行業(yè)中被廣泛應(yīng)用[2]。

國內(nèi)對于多糖的研究較為深入的有香菇多糖、枸杞多糖、靈芝多糖、海帶多糖、銀耳多糖等。這些研究集中于以粗提物為基礎(chǔ)，對其進(jìn)行提取純化工藝的優(yōu)化、成分分級、組成結(jié)構(gòu)的修飾等[3]。單糖組成、糖鏈構(gòu)象、聚合度以及離子的引入都會(huì)影響多糖的生物活性[4]。在生命科學(xué)及藥物化學(xué)領(lǐng)域，從機(jī)體組成生長發(fā)育到能量和物質(zhì)的新陳代謝、神經(jīng)信號的傳遞和免疫機(jī)制等許多生命活動(dòng)中金屬離子及其配體都起到重要的作用。王琴等[5]應(yīng)用主成分分析研究了不同地區(qū)枸杞中多糖和金屬元素之間存在顯著的相關(guān)性。蔣方程等[6]發(fā)現(xiàn)不同種山藥所含微量元素與多糖含量不盡相同，對應(yīng)的活性表現(xiàn)也略有不同。為提高多糖活性，目前的研究方向主要集中于多糖與目標(biāo)金屬離子的螯合。張新國等[7]將提取的黨參多糖作為載體，CaCl2為鈣源配位反應(yīng)生成黨參多糖鈣絡(luò)合物，有望成為一種潛在的新型補(bǔ)鈣劑。杜德紅等[8]利用多糖作為配體與硝酸鈰銨或混合稀土金屬進(jìn)行配位，制備多糖稀土配合物，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化且對磷脂鍵有良好的水解活性。目前關(guān)于多糖所含金屬元素組成及其在多糖中發(fā)揮的作用卻鮮有報(bào)道[9]。

本文選取枸杞、香菇、海帶3種原料提取多糖并檢測其金屬元素的組成及含量，使用EDTA-2Na絡(luò)合純化前、后的多糖金屬離子，比較改變金屬元素組成后多糖的抗氧化活性及抗腫瘤活性變化，探討多糖金屬元素組成對其活性的影響，為今后充分利用多糖資源，開發(fā)高活性有機(jī)物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 香菇、海帶、枸杞均購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.1.2 試劑 金屬混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；DPPH（1，1-dipheny-2-picrylhydrazy）、ABTS（2，2-azino-bis-3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid），美國Sigma公司；左旋谷氨酰胺、青霉素-硫酸鏈霉素雙抗混合液，北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；RPMI.1640培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胰酶-EDTA，美國Invitrogen公司；胎牛血清（FBS）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，依科賽生物科技（太倉）有限公司；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

8800 ICP-MS/MS，美國Agilent；Nicolet Nexus 470型紅外波譜儀，Thermo Electron公司；電子精密天平，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；CX41顯微鏡，日本Olympus公司；SpectraMax I3多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices；DL6MB型大容量離心機(jī)，西安禾普生物科技有限公司；HHS21-4電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，西安太康生物科技有限公司SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司；AdvantageA 5 Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的制備與純化 分別稱取一定質(zhì)量的海帶、香菇和枸杞原料于40℃烘干、粉碎，過40目篩。加入去離子水，在65℃攪拌浸提3 h后離心濃縮，分別得到粗海帶多糖（HP）、粗香菇多糖（XP）和粗枸杞多糖（GP）濃縮液。將3種濃縮液按體積比25∶4∶1加入正丁醇和氯仿，劇烈振搖后離心、收集糖液（Sevage法）。重復(fù)此步驟至溶液無白色蛋白層析出，得到純化海帶多糖（HD）、純化香菇多糖（XD）和純化枸杞多糖（GD）溶液。分別向純化前、后的多糖溶液中加入4倍體積95%乙醇，靜置12 h后，將沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，得到粉末狀樣品。取純化前、后的多糖樣品分別溶于去離子水，加入EDTA-2Na在4℃水浴震蕩8 h，得到EDTA-2Na處理后的EHP、EXP、EGP、EHD、EXD和EGD溶液。分別將各樣品溶液加至透析袋（3 500 u）中，4℃隔離透析72 h后收集并冷凍干燥[10]。

1.3.2 糖含量的測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖，配制1mg/mL的葡萄糖儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL儲(chǔ)備液，定容5 mL。分別吸取該系列溶液2mL于不同試管中，各加入1mL苯酚和5mL濃硫酸。放置5min后40℃加熱30min，冷卻后測定波長490 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 樣品的測定 取多糖稀釋液2mL，按上述方法測定吸光值，計(jì)算含量[11]。

1.3.3 蛋白含量的測定1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入85%磷酸120mL，定容1 000mL容量瓶。取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1mL，各加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分振蕩混勻，5 min后于波長595 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 樣品的測定 取樣品溶液0.1mL，按上述方法測定吸光值，計(jì)算含量[12]。

1.3.4 糖醛酸含量的測定1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/mL）于試管中，加水至1mL。在冰水浴中各加入6 mL濃硫酸，搖勻后85℃水浴鍋中保持2 h，測定波長530 nm處吸光值，以濃度對吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 樣品的測定 取1mL樣品溶液按上述方法測定吸光值，計(jì)算糖醛酸含量[12]。

1.3.5 金屬含量的測定1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制Al、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Pb、Ni、Sn標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/kg），使用串聯(lián)四級桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS/MS）測定其濃度，以金屬濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程[13]。

1.3.5.2 樣品的消化 準(zhǔn)確稱取20mg樣品于消化管中，加入硝酸消化，直至管內(nèi)溶液澄清透明[14]。冷卻后定容10mL。采用ICP法測定其各金屬含量。

1.3.6 多糖體外抗氧化活性的測定

1.3.6.1 羥自由基清除能力測定[15]向體系中分別加入1mL硫酸亞鐵（9mmol/L）、1mL水楊酸-乙醇（9mmol/L，以無水乙醇配制）和1mL樣品液，隨后加入1mL H2O2（8mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，37℃保溫0.5 h后測定波長510 nm處的吸光值A(chǔ)i。用蒸餾水代替H2O2的體系，測定多糖的本底吸收值A(chǔ)i0。按下列公式計(jì)算羥自由基清除率。

式中，A0——蒸餾水代替多糖溶液測得的吸光值；Ai——樣品吸光值；Ai0——多糖本底吸光值。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定[16]向試管中加2mL DPPH溶液（2×10-4mol/L，用甲醇配制）和2mL不同濃度多糖溶液，渦旋混勻，于黑暗條件下室溫反應(yīng)30min后測定波長517 nm處吸光值A(chǔ)i。以原溶劑調(diào)零，清除率計(jì)算公式：

式中，A0——甲醇代替多糖溶液測得的吸光值；Ai——樣品吸光值；Ai0——多糖本底吸光值。

1.3.6.3 ABTS自由基清除能力測定[17]將ABTS水溶液（7.4mmol/L）和過硫酸鉀水溶液（2.6mmol/L）等量混合，在室溫閉光條件下靜置12 h。測定時(shí)，用50%乙醇稀釋ABTS溶液，使其在波長734 nm處的吸光度在0.70±0.02范圍，形成ABTS自由基測定液。將0.1mL樣品用ABTS自由基測定液稀釋至3mL，準(zhǔn)確震蕩30 s，測定30℃反應(yīng)20 min后于波長734 nm處的吸光值A(chǔ)i。清除率計(jì)算公式：式中，A0——水代替多糖溶液測得的吸光值；Ai——樣品吸光值。

1.3.7 多糖體外抗腫瘤細(xì)胞活性的測定

1.3.7.1 MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng) 將人體乳腺癌細(xì)胞MCF-7置于含10%熱滅活FBS（胎牛血清）中培養(yǎng)，將2mmol/L左旋谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的5A、DMEM、RPMI-1640加入培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天換液1次，將細(xì)胞匯合，用胰酶-EDTA消化，傳代，保持細(xì)胞在良好的對數(shù)生長期。

1.3.7.2 多糖對MCF-7細(xì)胞活性的檢測 將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞分別以5 000個(gè)/孔（180mL/孔）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入待測香菇多糖溶液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對溶劑對照組加等量的培養(yǎng)基，藥物作用72 h后，每孔加入50%冰冷的三氯乙酸（TCA）固定細(xì)胞，SRB染色后，加入150mL/孔Tris溶液，于波長540 nm處測定吸光值[18]。

腫瘤細(xì)胞生長的抑制率按以下公式計(jì)算：

式中，Acontrol——培養(yǎng)基代替多糖溶液測得的吸光值；Asample——樣品吸光值。

1.3.7.3 MCF-7細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 使用顯微鏡對貼壁的人乳腺癌MCF-7腫瘤細(xì)胞形態(tài)觀察與拍照[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel數(shù)據(jù)處理軟件，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。采用Origin 8.5作圖。采用SPSS 19.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種多糖純化前、后的主要成分含量比較

測定3種多糖的糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量，結(jié)果列于表1。GD糖最高含量為74.08%，其次為GP和XD。蛋白與多糖含量相反，HP中蛋白最高含量為10.97%，而GD蛋白含量最低為1.29%。由表中數(shù)據(jù)可以看出除蛋白后仍有少量殘留。3種多糖的糖醛酸含量普遍較低。

表1 3種多糖純化前、后主要成分含量比較Table1 Composition of the contents of main components of three polysaccharides before and after purification

2.2 3種多糖純化前、后金屬元素組成及含量比較

以EDTA-2Na作為金屬螯合劑，脫除多糖樣品中的金屬成分，用ICP-MS/MS檢測在EDTA-2Na處理前、后多糖金屬元素的種類及含量。去除超純水，按上述消化方式測得的空白，結(jié)果見表2、3、4。

香菇、海帶、枸杞粗多糖中均含有Mg、Ca、Fe、Al、Pb等多種金屬元素，只是含量各不相同。其中，3種多糖均含有大量的Mg、Ca、K。經(jīng)過浸洗的淡干海帶中K的含量高達(dá)40 629mg/kg，大多以無機(jī)鹽的形式存在[20]，與檢測結(jié)果相符，海帶多糖中K的含量最高。海帶多糖中過高的K離子含量與其生長環(huán)境有關(guān)。香菇多糖與海帶多糖中的大部分金屬離子分布于純化多糖中，枸杞多糖中除Fe、Pb外，大部分金屬離子含量隨蛋白的去除而降低。

多糖經(jīng)EDTA-2Na處理后，含量較高的Ca、Fe、Pb、Zn等金屬離子脫除效果顯著（P＜0.05），而Ni、Sn、Cu等金屬離子含量較低，處理過程受水溶液、接觸器壁等環(huán)境因素影響較大，雖有一定的脫除效果但不顯著（P＞0.05）。從表2可以看出，除蛋白可在一定程度上降低多糖金屬離子密度。通過對3種多糖金屬含量的測定，推測多糖的金屬組成具有普遍性，其中EDTA-2Na脫除金屬離子效果較好。

表2 香菇多糖金屬組成及含量（mg/kg）Table2 Metal elements（mg/kg of sample）in Lentinan（mg/kg）

表3 海帶多糖金屬組成及含量（mg/kg）Table3 Metal elements（mg/kg of sample）in Laminarin（mg/kg）

表4 枸杞多糖金屬組成及含量（mg/kg）Table4 Metal elements（mg/kg of sample）in Lycium barbarum polysaccharides（mg/kg）

2.3 3種多糖純化前、后的抗氧化活性分析

2.3.1 2種多糖金屬元素對清除DPPH自由基活性的影響 DPPH即1，1-二苯基-2-苦基苯肼是一種穩(wěn)定的自由基，使其溶液顯示紫紅色，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，因與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，褪色程度用分光法進(jìn)行定量分析，以評價(jià)多糖活性[21]。樣品的清除率測定結(jié)果見圖1。在試驗(yàn)濃度范圍，樣品對DPPH自由基清除率隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)。純化多糖對DPPH自由基清除率均略高于粗多糖。枸杞多糖中，600μg/mL GD的清除活性高達(dá)59.8%，對應(yīng)EGD清除率降至38.4%，GP清除率為49.5%，而EGP清除率降至34.4%。同樣，香菇多糖和海帶多糖脫除金屬后對DPPH自由基清除活性均顯著下降（P＜0.05）。

圖1 海帶多糖（a）、香菇多糖（b）和枸杞多糖（c）清除DPPH自由基活性Fig.1 Scavenging effects of Laminarin（a），Lentinan（b）and Lycium barbarum polysaccharides（c）on DPPH radicals

2.3.2 3種多糖金屬元素對清除羥自由基活性的影響 羥自由基清除活性的原理為Fenton反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基（H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+）與反應(yīng)中加入的水楊酸生成于510 nm處有特殊吸收的2，3-二羥基苯甲酸，而羥自由基會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[22]。金屬離子的減少，對羥自由基的生成量有影響。3種多糖對羥自由基的清除結(jié)果見圖2。隨著反應(yīng)液中樣品濃度的增加，對·OH清除率呈上升的趨勢。純化枸杞與海帶多糖活性均高于粗多糖，其中枸杞多糖的活性改變最為顯著（P＜0.05）。通過對比，低濃度樣品經(jīng)EDTA-2Na處理后活性顯著下降（P＜0.05），隨著樣品濃度的升高，EDTA-2Na處理樣活性均高于原樣。因EDTA-2Na為強(qiáng)螯合劑，故推測其在多糖樣品中殘留，殘留量隨樣品濃度的升高而增大，尚未發(fā)揮作用的EDTA-2Na與反應(yīng)體系中生成的鐵離子螯合，使高濃度EDTA-2Na處理樣品組的活性大幅度升高。

2.3.3 3種多糖金屬元素對清除ABTS自由基活性的影響 ABTS在氧化劑的作用下氧化成綠色的ABTS·+，而抗氧化物存在時(shí)ABTS·+的產(chǎn)生被抑制，在波長734 nm處測定ABTS的吸光度即可反映樣品的總抗氧化能力。多糖為體系供應(yīng)電子，將游離自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定產(chǎn)物，從而終止氧化還原鏈反應(yīng)[23]。如圖3所示，多糖清除ABTS·+的能力與多糖濃度呈正相關(guān)。3種純化多糖EDTA-2Na處理組活性下降顯著（P＜0.05），表明金屬對多糖活性起促進(jìn)作用。推測由于多糖內(nèi)金屬脫除，供應(yīng)電子能力降低，導(dǎo)致其活性的下降。

圖2 海帶多糖（a）、香菇多糖（b）和枸杞多糖（c）清除羥自由基活性Fig.2 Scavenging effects of Laminarin（a），Lentinan（b）and Lycium barbarum polysaccharides（c）on hydroxyl radicals

圖3 海帶多糖（a）、香菇多糖（b）和枸杞多糖（c）清除ABTS自由基活性Fig.3 Scavenging effects of Laminarin（a），Lentinan（b）and Lycium barbarum polysaccharides（c）on ABTS radicals

2.4 枸杞多糖金屬元素對抗腫瘤活性的影響

2.4.1 對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7活性的影響 為進(jìn)一步考察多糖金屬元素組成對多糖活性的影響是否具有普遍性，以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為新的活性作用對象，研究多糖脫除金屬處理對腫瘤細(xì)胞增殖的影響[24]。 如圖4SRB試驗(yàn)表明，脫除金屬離子前、后的多糖均能不同程度地抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，且這種抑制作用隨樣品濃度的增大而增強(qiáng)。值得注意的是，在3 200μg/mL質(zhì)量濃度下EGD抑制活性高于GD。隨多糖濃度的降低，EGD抑制能力低于GD。推測在高濃度EGD中，殘留的EDTA-2Na導(dǎo)致細(xì)胞生長被抑制?？傮w來說在相同濃度下，GD與EGD的抑制率有一定的差異。

2.4.2 對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡形態(tài)學(xué)的影響 通過腫瘤細(xì)胞體外抑制試驗(yàn)進(jìn)行枸杞多糖（GD、EGD）活性對比。以無菌DMSO為陰性參比，多糖液為試驗(yàn)組，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化探討多糖內(nèi)金屬對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的影響[25]。如圖5所示，隨著多糖濃度的增大，24 h后其抑制率逐漸增大，表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到400μg/mL后，GD與EGD對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞增殖的抑制作用的差異開始展現(xiàn)。GD組的質(zhì)量濃度在800μg/mL時(shí)凋亡趨勢愈發(fā)明顯，幾乎半數(shù)細(xì)胞變?yōu)閳A形且不再貼壁，而EGD組多數(shù)呈梭型。枸杞多糖能夠較好地抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長，且含金屬離子的枸杞多糖抗腫瘤效果更佳。

圖4 枸杞多糖抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長活性Fig.4 Effect of Lycium barbarum polysaccharides on the proliferation of MCF-7 cells

圖5 不同濃度EGD（a）和GD（b）處理對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.5 Effect of MCF-7 cells treated with different concentrations of EGD（a）and GD（b）on cellular morphological

3 結(jié)論

采用水體醇沉法提取的香菇、海帶和枸杞多糖均含有Mg、Ca、Fe、Al、Pb等多種金屬元素，其含量各不相同。枸杞多糖的金屬離子集中分布于多糖的蛋白組成中，而香菇和海帶多糖中的金屬離子集中分布于多糖組成中。利用EDTA-2Na去除多糖粗品及純品中的金屬離子，結(jié)果表明其對含量較高的Ca、Fe、Pb、Zn等金屬離子脫除效果較好。

去除金屬后的3種多糖對ABTS自由基、DPPH自由基的清除活性均有所下降，其中枸杞多糖活性下降最為顯著（P＜0.05），推測多糖金屬組成成分對其活性有一定的促進(jìn)作用。枸杞多糖純品對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制活性高于去除金屬離子的樣品，驗(yàn)證了多糖金屬元素組成對其活性的影響。