綠豆皮黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

羅 磊 姬青華 馬麗蘋 樊金玲 朱文學(xué) 杜冠尚

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心 河南洛陽471023）

血管內(nèi)皮細(xì)胞是指襯于心、血管以及淋巴管內(nèi)表面單層扁平上皮細(xì)胞，能夠起到調(diào)節(jié)血管張力，維持其正常功能的作用[1]。動(dòng)脈粥樣硬化、腦缺血、心肌梗死等心血管性疾病常與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能失調(diào)有關(guān)[2]。自由基的氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、核酸和氨基酸的過氧化損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并引發(fā)功能紊亂，甚至導(dǎo)致細(xì)胞衰老、癌變和死亡[3-5]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧是參與血管內(nèi)皮損傷的主要病理因素。H2O2是體內(nèi)常見活性氧，能夠與細(xì)胞內(nèi)Fe2+生成活性更強(qiáng)的羥自由基，并作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)，造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而引發(fā)細(xì)胞膜損傷[6]?，F(xiàn)今抗氧化物質(zhì)終止自由基作用的相關(guān)研究備受重視[7]，從天然產(chǎn)物中提取抗氧化劑成為新型藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，而黃酮類化合物正是重要的來源。

綠豆是我國(guó)傳統(tǒng)飲食的重要原料之一，中醫(yī)認(rèn)為綠豆及花、葉、種皮均可入藥，其味甘性寒，可清熱解毒、消腫利尿[8]。研究發(fā)現(xiàn)，綠豆的抗氧化能力通常被認(rèn)為是種皮中的多酚類物質(zhì)提供的，而酚類物質(zhì)主要來源于綠豆皮中，其抗氧化成分占到整個(gè)綠豆的87%[9]。牡荊素和異牡荊素是綠豆皮中主要的黃酮類物質(zhì)，分別占綠豆皮總黃酮的51.99%和45.42%，并被認(rèn)為是主要的抗氧化劑成分[10]。對(duì)于綠豆皮黃酮物質(zhì)的抗氧化作用已引起研究者的重視。有研究發(fā)現(xiàn)從綠豆皮干粉中提取的黃酮的自由基清除率與VC相當(dāng)[11-12]。張競(jìng)競(jìng)等[13]研究表明，高溫處理后灌胃綠豆皮水提液對(duì)大鼠血清抗氧化能力提高效果明顯；Jang等[14]研究發(fā)現(xiàn)綠豆皮能夠明顯改善Ⅱ型糖尿病小鼠的高血糖和抗氧化狀態(tài)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于綠豆皮黃酮物質(zhì)的抗氧化研究主要集中在體外抗氧化及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面，有關(guān)綠豆皮黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的報(bào)道較少。本試驗(yàn)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，建立H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，研究綠豆皮黃酮對(duì)HUVEC細(xì)胞的SOD、GSH-Px、LDH活力及GSH、MDA含量的影響，探討綠豆皮黃酮物質(zhì)對(duì)抗細(xì)胞損傷作用及其機(jī)制，為綠豆皮應(yīng)用于心血管疾病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

牡荊素（CAS號(hào)：29702-25-8）和異牡荊素（CAS號(hào)：3681-93-4），上海源葉生物科技有限公司；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），舜冉（上海）生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，Hyclone公司；噻唑藍(lán)，sigma公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清、胰酶，Gibco公司；SOD、GSHPx、GSH、MDA及LDH試劑盒，南京建成；其它藥品均為生化試劑或分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

CKX41倒置顯微鏡，OLYMPUS公司；酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司；旋渦儀，上海滬西；UV2400紫外-可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平；Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫；E191IR型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，金西盟公司；LDZX-50KB壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SCIENTZ-10N凍干機(jī)，新芝生物科技公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HL-2D恒流泵，上海圣科。

1.3 試驗(yàn)方法及內(nèi)容

1.3.1 綠豆皮黃酮的提取及含量測(cè)定 綠豆皮粉末和70%的乙醇按1∶20混勻，540W功率微波提取80 s，提取液4 800 r/min離心10min，40℃下旋蒸除醇，然后加4倍體積乙醇除蛋白質(zhì)、多糖，經(jīng)過濾、離心、濃縮。采用醋酸-醋酸鈉-三氯化鋁顯色法[15]進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最大吸收峰在270 nm處。以蘆丁為標(biāo)樣，所得回歸方程：y=25.405x+0.1285（x：黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；y：吸光度），相關(guān)系數(shù)R2為0.9963。移取0.4mL黃酮提取液至10 mL具塞刻度試管中，在270 nm處測(cè)吸光度，按下面公式計(jì)算綠豆皮黃酮含量。

式中，C——提取液黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V——提取液體積（mL）；N——稀釋倍數(shù)；M：原料質(zhì)量（g）。

1.3.2 綠豆皮黃酮的純化 根據(jù)文獻(xiàn)[16]做適當(dāng)修改，通過優(yōu)化得到純化條件。將預(yù)處理完畢的樹脂NKA-9裝入1.6 cm×60 cm玻璃層析柱，柱床體積（1 BV）80mL。將2 BV質(zhì)量濃度為0.45mg/mL的綠豆皮黃酮提取液（pH 3）上樹脂柱吸附，待充分吸附后，先用2 BV的蒸餾水洗脫除雜，再用2.3 BV 70%的乙醇溶液（pH 5）為洗脫劑，以2.5 BV/h洗脫，收集洗脫液，濃縮冷凍干燥得到綠豆皮黃酮粗提物。

1.3.3 HPLC分析 標(biāo)樣制備：精密稱取牡荊素、異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用甲醇溶解定容10mL，所得混合標(biāo)樣質(zhì)量濃度分別為210μg/mL和220μg/mL[17]。

供試液制備：將1.3.1節(jié)中制備的綠豆皮黃酮0.0036 g用甲醇溶解并定容10mL，過0.45μm濾膜，得樣品溶液。

高效液相色譜工作條件：色譜柱：安捷倫SBC18反相色譜柱；柱溫：25℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：268，335 nm；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A甲醇，B 1%PBS緩沖液；洗脫梯度：0～15 min，25%A，75%B；15～20min，100%A，0%B；流速：0.6mL/min；后運(yùn)行時(shí)間：5min。

1.3.4 細(xì)胞抗氧化

1.3.4.1 HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng) 配制DMEM高糖培養(yǎng)基，其中含1%雙抗和10%胎牛血清，并將適量培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后進(jìn)行細(xì)胞接種，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)[18]。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率70%~80%時(shí)傳代，按照細(xì)胞生長(zhǎng)速度按時(shí)更換培養(yǎng)液。

1.3.4.2 HUVEC細(xì)胞氧化損傷模型的建立 以每孔200μL的量將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞接種于96孔板，使其細(xì)胞密度達(dá)到2.0×105個(gè)/mL。在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在觀察到細(xì)胞貼壁時(shí)，棄上清，加入不同濃度梯度的H2O2溶液，每個(gè)梯度6個(gè)平行。培養(yǎng)24 h棄上清，緩沖液洗滌2次，每孔加入200μL培養(yǎng)基和10μL質(zhì)量濃度5mg/mL的MTT，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150μL DMSO，室溫放置10min，放入酶標(biāo)儀，在490 nm處測(cè)定其吸光度。按照下列公式來計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中，A0——空白組；A1——不同濃度H2O2組。

1.3.4.3 綠豆皮黃酮質(zhì)量濃度的篩選 方法同

1.3.4.2 節(jié)，僅將所加入的“不同濃度梯度H2O2溶液”替換為不同濃度的綠豆皮黃酮溶液。

1.3.4.4 SOD、GSH-Px、GSH、MDA、LDH測(cè)定將HUVEC細(xì)胞（密度2.0×105個(gè)/mL）接種于6孔板中，每孔加入2.0mL，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，當(dāng)觀察到細(xì)胞完全貼壁，立即吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液。對(duì)空白組和H2O2損傷組分別加入培養(yǎng)基2.0mL；對(duì)試驗(yàn)組分別加入2.0mL不同質(zhì)量濃度綠豆皮黃酮培養(yǎng)液；VC對(duì)照組中加入質(zhì)量濃度為250 g/mL的VC培養(yǎng)液2.0mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，每孔加入2.0mL 750mol/L H2O2溶液，培養(yǎng)4 h后分離細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液。離心（4℃，1 500 r/min，5min）細(xì)胞培養(yǎng)液，取上清，待測(cè)。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，離心（4℃，1 000 r/min，10min），留細(xì)胞團(tuán)塊。加入0.5mL磷酸鹽緩沖液，在冰水浴中超聲破碎，超聲條件為400W，3～5 s/次，間隔30 s，重復(fù)3次。按照試劑盒說明書方法測(cè)定細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、GSHPx、GSH、MDA、LDH水平。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計(jì)分析所用軟件為DPS 7.5，采用ORIGIN85軟件作圖，數(shù)據(jù)采取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法作多重比較，用不同小寫字母顯示組間差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC結(jié)果

對(duì)經(jīng)NKA-9大孔吸附樹脂純化的綠豆皮黃酮進(jìn)行液相分析，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，由圖1可知，綠豆皮提取物中主要含有牡荊素和異牡荊素兩種碳苷類黃酮，占提取物總黃酮的90%以上。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatogram of reference substances and sample

2.2 細(xì)胞抗氧化結(jié)果

2.2.1 H2O2濃度對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響如圖1所示，在一定濃度范圍內(nèi)，HUVEC細(xì)胞存活率隨H2O2濃度的升高而降低。當(dāng)H2O2質(zhì)量濃度低于500μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率在90%以上；當(dāng)質(zhì)量濃度在500～1 000μmol/L范圍時(shí)，細(xì)胞存活率顯著下降，在質(zhì)量濃度為1 000μmol/L時(shí)有54.49%的存活率；當(dāng)H2O2濃度大于1 000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率在30%以下。綜合考慮后選用1 000μmol/L H2O2作用24 h作為最佳造模條件。

2.2.2 綠豆皮黃酮濃度對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響從圖2可以看到，綠豆皮黃酮質(zhì)量濃度在0～80μg/mL范圍時(shí)，能夠顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖分化；在綠豆皮黃酮質(zhì)量濃度0～20μg/mL范圍，對(duì)細(xì)胞的增殖作用不明顯，而當(dāng)質(zhì)量濃度為20，60，80μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率分別達(dá)到108.98%，118.41%和128.33%，大大促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)；當(dāng)綠豆皮黃酮的質(zhì)量濃度大于80μg/mL時(shí)，顯著抑制HUVEC細(xì)胞的增殖（P＜0.05），其存活率顯著下降，達(dá)到77.32%。選擇質(zhì)量濃度為20，60，80μg/mL的綠豆皮黃酮做后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同濃度H2O2對(duì)HUVECs增殖的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of hydrogen peroxide on the viability of HUVECs

圖3 不同濃度綠豆皮黃酮對(duì)HUVECs增殖作用的影響Fig.3 Dose-dependent effects of flavonoids from mung bean hull on the viability of HUVECs

2.2.3 HUVEC細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液SOD活性研究SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的第一道防線，主要清除O2-，催化其發(fā)生歧化反應(yīng)，將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，從而達(dá)到清除自由基的目的[19-20]。SOD活力的高、低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。從圖2可以看到，相對(duì)于空白組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD活性，H2O2損傷組顯著降低（P＜0.05），綠豆皮黃酮各劑量組呈劑量依賴性地提高細(xì)胞和培養(yǎng)液中SOD活性。與VC對(duì)照組細(xì)胞中的SOD活性相比，綠豆皮黃酮各劑量組均有顯著差異（P＜0.05），而低劑量除外。其它劑量組與VC對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.4 HUVEC細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液GSH-Px活性研究 GSH-Px是一種有機(jī)體內(nèi)廣泛存在的能特異催化還原性谷胱甘肽（GSH）還原H2O2的酶，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能顯著的保護(hù)作用，能夠延緩衰老[21]。從圖4可以看到，相對(duì)于空白組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性，模型組呈顯著下降（P＜0.05），而綠豆皮黃酮各劑量組與模型損傷組相比，細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH-Px的活性得到顯著提升（P＜0.05），呈一定的量效依賴關(guān)系。其中各劑量組細(xì)胞中GSH-Px的活性差異顯著。高劑量組在細(xì)胞和培養(yǎng)液中的GSH-Px活性與VC組相比差異不顯著（P＞0.05），這表明綠豆皮黃酮起到催化GSH對(duì)氫過氧化物的還原反應(yīng)，阻斷體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的重要作用。

圖4 HUVEC細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液的SOD活性Fig.4 SOD activities in HUVEC cells and cell culture medium

圖5 HUVEC細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性Fig.5 GSH-Px activities in HUVEC cells and cell culture medium

2.2.5 HUVEC細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性LDH是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，LDH一種細(xì)胞內(nèi)的糖酵解酶，廣泛存在于細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受損或細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變時(shí)，LDH由細(xì)胞滲透至培養(yǎng)液中的量明顯增多，因此，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性可以客觀衡量細(xì)胞受損程度[22-23]。如圖5所示，與空白組相比，終濃度為1 000μmol/L的H2O2作用24 h后，模型組細(xì)胞LDH活力明顯下降，而細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量較高，說明細(xì)胞受H2O2損傷后發(fā)生LDH泄露，使培養(yǎng)液中含量增加。相對(duì)于H2O2損傷組，綠豆皮黃酮各劑量組細(xì)胞中LDH活性明顯升高，而細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性有所下降（P＜0.05），表明綠豆皮黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞膜受損有預(yù)防或減緩作用，能夠阻止細(xì)胞內(nèi)LDH向細(xì)胞外擴(kuò)散。與VC對(duì)照組相比，綠豆皮黃酮高劑量組細(xì)胞中LDH含量差異不顯著（P＞0.05），而各劑量組在培養(yǎng)液中LDH活性差異顯著，高于VC對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2.6 HUVEC細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH活性GSH是細(xì)胞內(nèi)源性巰基抗氧化劑，能有效防止脂質(zhì)過氧化，從而減輕氧化應(yīng)激造成的損傷[24-27]。如圖6所示，H2O2模型組在細(xì)胞和培養(yǎng)液中的GSH含量顯著低于空白組（P＜0.05），與H2O2模型組相比，綠豆皮黃酮各劑量組對(duì)由H2O2引起的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液GSH含量下降起到明顯的抑制作用（P＜0.05），呈劑量依賴性。綠豆皮黃酮高劑量組在細(xì)胞中的GSH含量與VC對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），而在培養(yǎng)液中GSH含量與VC對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），相對(duì)于與VC組細(xì)胞和培養(yǎng)液中的GSH含量，低、中劑量組呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。

2.2.7 HUVEC細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液的MDA含量MDA是脂質(zhì)過氧化過程中的代謝產(chǎn)物，是極其活潑的交聯(lián)劑，能引起DNA、蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合，影響細(xì)胞的分裂，破壞蛋白和酶的結(jié)構(gòu)與功能，從而反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞受損程度[28-30]。從圖7可以看到，H2O2損傷24 h后，相對(duì)于空白組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量，H2O2模型組均顯著升高（P＜0.05）。相對(duì)于H2O2模型組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量，綠豆皮黃酮各劑量組均能夠顯著抑制由H2O2引起的MDA含量增加（P＜0.05），同時(shí)表現(xiàn)出劑量依賴性，且當(dāng)綠豆皮黃酮在高劑量即質(zhì)量濃度為80μg/mL時(shí)，與VC對(duì)照組的MDA含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖8 HUVEC細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液的MDA含量Fig.8 MDA content in HUVEC cells and cell culture medium

以體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行H2O2誘導(dǎo)，建立HUVEC氧化應(yīng)激損傷模型，探究綠豆皮黃酮對(duì)H2O2損傷HUVEC的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。研究結(jié)果表明，H2O2能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并顯著降低細(xì)胞存活率，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1 000μmol/L，細(xì)胞存活率約為50%，造成細(xì)胞損傷；綠豆皮黃酮的質(zhì)量濃度在20～80μg/mL范圍時(shí)，能夠促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖。HUVEC細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷，細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液中的有害物質(zhì)MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px、LDH活性降低較為顯著，而添加不同劑量綠豆皮黃酮時(shí)，損傷細(xì)胞抗氧化活性均表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)，并存在劑量依賴性。綠豆皮黃酮能提高細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中各種抗氧化活性指標(biāo)，降低MDA含量，增加GSH活性，減輕LDH向細(xì)胞外的擴(kuò)散。

3 結(jié)論

綜上所述，綠豆皮黃酮可以顯著減緩H2O2誘導(dǎo)的HUVEC損傷而導(dǎo)致抗氧化活性下降，提高細(xì)胞內(nèi)各類抗氧化酶的活性，降低機(jī)體內(nèi)氧活性和有害物質(zhì)含量，維持細(xì)胞穩(wěn)定。綠豆皮黃酮的保護(hù)作用機(jī)理是：抑制脂質(zhì)過氧化并清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化酶活性，修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞。