利用SPDE-MAL-DI-TOF-MS快速篩查生物樣品中的百草枯和敵草快

高原

（中國(guó)刑事警察學(xué)院 遼寧沈陽(yáng) 110854）

百草枯和敵草快是除草效果很好的吡啶鎓離子類除草劑，但是隨著百草枯中毒案件的增多，敵草快逐步登上市場(chǎng)。部分廠商在敵草快中加入百草枯制成混合制劑，因此兩者混合導(dǎo)致的中毒案件增加[1]。

百草枯和敵草快的分析主要通過氣相色譜質(zhì)譜分析[2][3][4][5]、毛細(xì)管電泳[6][7]、液相色譜[8][9][10][11]和液相色譜質(zhì)譜分析[12][13][14][15][16][17][18]等方法來進(jìn)行。這些方法雖然能夠準(zhǔn)確地對(duì)百草枯與敵草快進(jìn)行定性定量分析，但是對(duì)于兩者的混合制劑的檢驗(yàn)需要優(yōu)化色譜條件來達(dá)到組分的分離，同時(shí)需要調(diào)節(jié)色譜參數(shù)分析低含量組分，增加了分析的時(shí)間。而案件現(xiàn)場(chǎng)檢材種類繁多、案件復(fù)雜多樣，同時(shí)基層單位委托檢驗(yàn)時(shí)并無明確的目標(biāo)、案件偵破需要快速性與準(zhǔn)確性。這就要求盡可能地減少分析時(shí)間、無需分離直接分析混合物來達(dá)到快速篩查檢驗(yàn)百草枯與敵草快的目的。通過添加氫氧化鈉和亞硫酸氫鈉進(jìn)行的顯色試驗(yàn)多被作為簡(jiǎn)單判斷是否含有百草枯和敵草快的方法。但是，由于生物樣品中含有各種混雜物，檢驗(yàn)者必須用固相萃取小柱進(jìn)行預(yù)處理。傳統(tǒng)的固相萃取法耗時(shí)長(zhǎng)。此外，能夠通過目視確認(rèn)百草枯存在的濃度是1μg/mL左右，敵草快濃度是3μg/mL左右，因此顯色試驗(yàn)僅適用于濃度比較高的情況。

固相分散萃取法（SPDE）作為固相萃取法的一種，萃取時(shí)間短、可以同時(shí)處理多個(gè)受檢樣品，因此該方法可以快速篩查生物樣品中的農(nóng)藥。將固相分散萃取法應(yīng)用到生物樣品中的安眠藥和危險(xiǎn)毒品分析的案例見諸報(bào)告[19][20]，卻未見用于萃取生物樣品中百草枯與敵草快的文獻(xiàn)報(bào)道。

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）可以直接用于混合物的分析。其具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高等特點(diǎn)，可以檢測(cè)出濃度很低的目標(biāo)物，同時(shí)其具備獲取質(zhì)量精確且檢測(cè)時(shí)間極短的優(yōu)點(diǎn)。用MALDI-TOF-MS進(jìn)行的人尿、血液、組織的藥品毒品分析可在一些報(bào)告[21][22][23][24][25][26][27][28][29]中找到，但沒有發(fā)現(xiàn)適用于PQ和DQ檢測(cè)的報(bào)告。

另外，理想情況下，應(yīng)將犯罪鑒定過程中的檢材的消耗限定在最小必要限度內(nèi)，以備再鑒定使用，樣品使用量應(yīng)盡可能少。

因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)相對(duì)少量的生物樣品（全血、血清和尿液）中的百草枯和敵草快，將極少量的基質(zhì)溶液用于固相分散萃取法中的洗脫液，并將該洗脫液直接供給MALDI-TOF-MS進(jìn)行快速檢驗(yàn)篩查，具有獨(dú)特性。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）實(shí)驗(yàn)試劑

百草枯二氯化物、敵草快二溴水合物、α-氰基-羥基肉桂酸(CHCA)、2，5-二羥基苯甲酸(DHB)（安譜公司），乙腈（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），0.2%三氟乙酸水溶液（美國(guó)Fisher公司），甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司），全血、人尿、人血清（Sigma-Aldrich公司），超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)），固相萃取劑Oasis?MCX(30μm)（北京金歐亞科技發(fā)展有限公司）。

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），微型旋渦混合儀（上海瀘西分析儀器廠有限公司），高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），微量恒溫儀（北京美華儀科技有限公司），ultrafleXtremeTMMALDI-TOF-MS系統(tǒng)（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司），KQ-200VDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SmartbeamTMII激光器（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司），MTP 384靶板磨光鋼（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司），Waters Oasis MCX固相萃取柱（北京金歐亞科技發(fā)展有限公司）。

（二）實(shí)驗(yàn)流程

1.樣品的制備。將PQ二氯化物和DQ二溴水合物在105℃下干燥2小時(shí)后，稱取13.8mg的PQ二氯化物和18.7mg的DQ二溴水合物，分別溶解在100 mL超純水中，制備PQ和DQ的標(biāo)準(zhǔn)溶液（各100μg/mL）。將其適量添加到人全血、人血清和人尿中，制備出實(shí)驗(yàn)所需濃度的樣品。

2.固相懸濁液的制備。在Oasis?MCX填充小柱(150mg/6cc)中依次通入6mL的甲醇、6mL的超純水，清洗固相后，在小柱中通入氮?dú)鈱埩舻募状颊麴s去除，使固相干燥。之后取下小柱蓋，取固相100mg，加入10mL的超純水，制備出10mg/mL的固相懸浮液。

3.基質(zhì)溶液的制備。稱取20mg的CHCA，加入1mL的0.2%三氟乙酸水溶液/乙腈混合液(1:1，v/v)，進(jìn)行超聲處理（5分鐘），通過離心分離使溶解殘留的CHCA沉淀，取上清液作為基質(zhì)溶液。

4.樣品預(yù)處理、SPDE萃取。（1）去蛋白處理。將0.1mL的全血樣品或血清樣品采集到1.5mL容量的塑料微管中，用0.1mL的超純水稀釋后，加入0.4mL的乙腈，用漩渦混合器攪拌1分鐘，進(jìn)行離心分離(10000rpm/min)，取0.5mL上清液進(jìn)行SPDE。（2）SPDE萃取PQ與DQ。①?gòu)娜獦悠泛脱鍢悠分休腿?。將上述“?）”步驟中獲取的0.5mL的全血樣品或血清樣品的去蛋白液倒入1.5mL容量的塑料微管內(nèi)，加入0.9mL的超純水和0.1mL的固相懸濁液，用漩渦混合器攪拌(30s)后進(jìn)行離心分離(10000rpm/30s)，去除上清液。在底部殘留的固相中加入1mL的超純水，攪拌(10s)清洗后進(jìn)行離心分離，去除上清液。接著加入1mL的甲醇，反復(fù)進(jìn)行同樣操作。通過在微量恒溫儀(60℃)上加熱微管，將殘留的微量甲醇蒸餾去除。在該干燥固相中加入8μL的基質(zhì)溶液，通過超聲處理(1min)洗脫后進(jìn)行離心分離(10000rpm/30s)，取0.5mL的萃取液涂到靶板上。②從尿樣中萃取。將尿樣進(jìn)行離心分離后取0.1mL的上清液倒入1.5mL容量的塑料微管內(nèi)，加入1.3mL的超純水稀釋后，加入0.1mL的固相懸濁液，用漩渦混合器攪拌(30s)后進(jìn)行離心分離(10000rpm/30s)，去除上清液。后續(xù)的清洗和洗脫的方法與上述“①”步驟的方法相同。

5.基質(zhì)輔助激光解吸電離—飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)分析。將上述“4.（2）”步驟獲得的萃取液進(jìn)行分析，儀器條件如下：激光器重復(fù)頻率：1000Hz；激光沖擊次數(shù)：500次；MS校準(zhǔn)：m/z 190.0498(CHCA，[M+H]+)和m/z 172.0393(CHCA，[M-H2O+H]+)；質(zhì)量誤差：6.4ppm(PQ)、8.1ppm(DQ)；激光輸出功率：50%；檢測(cè)模式：正離子反射模式(m/z 0-300)；質(zhì)量分辨率：M+·:2000～4000(PQ和DQ)；樣品量：0.5μL。

二、結(jié)果與討論

（一）關(guān)于預(yù)處理的討論

1.全血樣品和血清樣品的去蛋白處理。對(duì)于全血樣品和血清樣品，由于其含有離心分離難以完全去除的成分，因此SPDE之前必須進(jìn)行去蛋白處理。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙醇和乙腈三種試劑去蛋白處理的效果。。血清樣品中，用該3種有機(jī)劑沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。但是用乙醇對(duì)全血樣品進(jìn)行去蛋白處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，在去蛋白液中加入超純水時(shí)有渾濁現(xiàn)象產(chǎn)生，其與固相一起沉淀，因此乙醇不能用于去蛋白處理。用甲醇時(shí)，血紅素蛋白質(zhì)不能被徹底去除且上清液去除蛋白后呈淡紅色。此后，用SPDE萃取后進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與乙腈相比這種情況下的PQ和DQ的檢測(cè)強(qiáng)度偏低。因?yàn)闅埩舻难t素蛋白質(zhì)干擾了PQ和DQ的萃取。綜上，本實(shí)驗(yàn)采用了乙腈進(jìn)行去蛋白處理。

2.固相分散萃取法（SPDE）。百草枯和敵草快都是陽(yáng)離子化合物，因此本實(shí)驗(yàn)采用了Oasis?MCX進(jìn)行快速預(yù)處理。用Oasis?MCX量取0.5mg、1mg、2mg固相進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，PQ和DQ的檢測(cè)強(qiáng)度關(guān)系為0.5mg＜1mg≒2mg。但固相用量為2mg時(shí)，洗脫時(shí)的上清液比率低且采集困難，所以固相用量采用了1mg。同時(shí)，采用固相用量1mg時(shí)，將粒子直徑為30μm和60μm的Oasis?MCX進(jìn)行對(duì)比，沒有發(fā)現(xiàn)差異。為了節(jié)省材料，在本實(shí)驗(yàn)中采用了粒子直徑為30μm的Oasis?MCX。

與傳統(tǒng)的SPE技術(shù)比較，SPDE可以任意調(diào)整固相用量，需要的洗脫液減少；可以通過攪拌、離心等簡(jiǎn)單操作完成留存和清洗步驟，濃縮所需時(shí)間短。在本實(shí)驗(yàn)中，由于使用的基質(zhì)溶液是酸性的，因此將極少量（8μL）溶液用作洗脫液以便省略一般必要的濃縮過程，進(jìn)一步縮短了萃取時(shí)間。綜上，本次建立的以PQ和DQ為目標(biāo)的SPDE可作為快速篩查的萃取法使用。

（二）基質(zhì)輔助激光解吸電離—飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）

1.基質(zhì)的類型和濃度。當(dāng)今在MALDI-TOF-MS中廣泛使用的基質(zhì)溶液是α-羥基氰基肉桂酸（CHCA）和2，5二羥基苯甲酸（DHB）。本實(shí)驗(yàn)配制了上述兩種基質(zhì)溶液（配制方法見實(shí)驗(yàn)流程“3.”），并分別添加PQ和DQ標(biāo)準(zhǔn)溶液（最終0.2μg/mL）后涂抹在靶板上進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：兩者都能檢測(cè)到百草枯和敵草快。但在DHB條件下，靶板上形成了不均勻的針狀晶體，并且百草枯和敵草快的檢測(cè)強(qiáng)度會(huì)隨著激光照射位置的不同而變化很大，還有些位置沒有被檢測(cè)到。因此，DHB條件下判斷PQ和DQ的是否存在耗時(shí)且不準(zhǔn)確，不予采用。相反，在CHCA條件下形成了比較均勻的薄膜，并且百草枯和敵草快的檢測(cè)強(qiáng)度隨著激光照射位置的不同幾乎沒有變化。綜上，采用CHCA作為基質(zhì)。圖1表示的是將基質(zhì)溶液涂抹到靶板的狀態(tài)。

圖1 DHB（左）與CHCA（右）作為基質(zhì)溶液應(yīng)用在靶板上的光學(xué)影像

2.質(zhì)譜法。在基質(zhì)溶液中添加PQ和DQ標(biāo)準(zhǔn)溶液（最終0.2μg/mL）并進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：在百草枯（M+·精確質(zhì)量值是186.1157）中明顯檢測(cè)出自由基正離子M+·(m/z 186.11)（圖2），在敵草快（M+·精確質(zhì)量值是184.1000）中明顯檢測(cè)出自由基正離子M+·(m/z 184.10)以及去質(zhì)子化離子[M-H]+(m/z 183.10)（圖3）。同時(shí)，也能檢測(cè)出兩者混合質(zhì)譜（圖4）。因此，可以根據(jù)M+·的檢測(cè)結(jié)果判斷是否含有百草枯，根據(jù)M+·和[M-H]+的檢測(cè)結(jié)果判斷是否含有敵草快。

圖2 含有0.2μg/mLPQ的基質(zhì)溶液的MALDI-TOF質(zhì)譜圖

圖3 含有0.2μg/mLDQ的基質(zhì)溶液的MALDI-TOF質(zhì)譜圖

圖4 含有0.2μg/mLPQ與DQ混合制劑的基質(zhì)溶液的MALDI-TOF質(zhì)譜圖

（三）優(yōu)化條件下的各樣品的檢測(cè)和檢出限

根據(jù)優(yōu)化條件對(duì)各樣品（PQ和DQ添加濃度：0μg/mL（空）、0.05μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL）進(jìn)行萃取、檢測(cè)，結(jié)果表明：濃度為0的全血、血清以及尿液中未檢出百草枯和敵草快，而在其他添加濃度的樣品中百草枯和敵草快均被檢出。低濃度（0.05μg/mL）的樣品，也能通過足夠的S/N被檢測(cè)出來（圖5、6和7）。同時(shí)，在計(jì)算該條件下的質(zhì)量分辨率（半峰寬法）時(shí)，發(fā)現(xiàn)百草枯和敵草快的M+·約為2000～4000。以m/z 186.11（百草枯，M+·）和m/z 183.10（敵草快，[M-H]+）為基準(zhǔn)計(jì)算檢測(cè)限（S/N＞3）時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有樣品的PQ為0.002μg/mL，DQ為0.01μg/mL。

圖5 空白全血（上）與PQ和DQ混合制劑添加濃度為0.05μg/mL的全血樣品（下）的MALDI-TOF質(zhì)譜圖

圖6 空白血清（上）與PQ和DQ混合制劑添加濃度為0.05μg/mL的血清樣品（下）的MALDI-TOF質(zhì)譜圖

圖7 含有不同PQ與DQ混合制劑濃度的尿液樣品的MALDI-TOF質(zhì)譜圖（空白（左上），0.05μg/mL（右上），0.5μg/mL（左下），5μg/mL（右下））

對(duì)于添加濃度為0的全血、血清和尿液，我們將含有百草枯和敵草快(各0.2μg/mL)的基質(zhì)溶液用作洗脫液進(jìn)行萃取，對(duì)得到的萃取物進(jìn)行了檢測(cè)。將此時(shí)的百草枯和敵草快的檢測(cè)強(qiáng)度與采用的基質(zhì)溶液自身受檢時(shí)的檢測(cè)強(qiáng)度進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)基本無差異。因此可以認(rèn)為生物樣品和固相幾乎沒有引發(fā)基質(zhì)效應(yīng)。

在毒物毒品分析領(lǐng)域，有些藥物因其質(zhì)量數(shù)和百草枯或敵草快一樣，可能會(huì)干擾到對(duì)百草枯或敵草快存在與否的判斷。例如，芽子堿（M+H的精確質(zhì)量計(jì)算值為186.1124）、氯代麻黃堿、氯代甲基苯丙胺以及氯苯吡胺（M+H的精確質(zhì)量計(jì)算值均為184.0887），在該條件下，很難通過質(zhì)量分辨率（約2000～4000）識(shí)別百草枯和敵草快。因此，對(duì)于該方法下可能存在百草枯和敵草快的樣品，必須通過LC-MS進(jìn)行檢查才能做出最終判斷。

與傳統(tǒng)顯色試驗(yàn)相比，本項(xiàng)研究中建立的利用MALDI-TOF-MS檢測(cè)PQ和DQ的方法雖然復(fù)雜一點(diǎn)，但在獲取用以判斷百草枯和敵草快是否存在的質(zhì)量信息和檢測(cè)靈敏度方面表現(xiàn)優(yōu)異。因此，該方法可以在藥品毒品分析中作為PQ枯和DQ的快速檢驗(yàn)篩查的方法使用。

三、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的目的是采用MALDI-TOF-MS檢測(cè)相對(duì)少量（0.1mL）的生物樣品（全血、血清和尿液）中是否存在百草枯和敵草快。通過對(duì)全血樣品和血清樣品用乙腈去除蛋白，對(duì)尿液進(jìn)行離心分離。使用Oasis?MCX進(jìn)行SPDE，將基質(zhì)溶液用作洗脫液并直接對(duì)洗脫液進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）與顯色試驗(yàn)這種傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，利用MALDI-TOF-MS檢測(cè)百草枯和敵草快的方法雖然復(fù)雜一些，但它可以獲取質(zhì)量信息，進(jìn)一步提高檢測(cè)敏感度（百草枯提高可以200倍，敵草快可以提高150倍）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明即使在輕度中毒程度的低濃度（0.05μg/mL）樣品中也能很好地檢測(cè)出百草枯和敵草快。（2）SPDE操作彌補(bǔ)了傳統(tǒng)固相萃取法洗脫時(shí)間長(zhǎng)的缺陷。其可以實(shí)現(xiàn)快速萃取樣品、同時(shí)處理多個(gè)受檢樣品，并且固相用量非常少（1 mg），所以可以降低成本。（3）與使用儀器分析的傳統(tǒng)方法[2][3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18]相比，雖然無法通過色譜或電泳將目標(biāo)物與混雜物分離，但本方法準(zhǔn)確度高，可以直接對(duì)混合物進(jìn)行分析，單個(gè)受檢樣品的檢測(cè)所需時(shí)間（包括靶板樣品涂抹時(shí)間和設(shè)備導(dǎo)入時(shí)間）很短，所以本方法在多樣品條件下具有優(yōu)勢(shì)。

綜上，本方法可以在農(nóng)藥毒物分析中作為百草枯和敵草快的快速檢驗(yàn)篩查方法使用。