骨 肉 瘤 免 疫 療 法 的 研 究 進 展

黃 重 賈瑞鵬 鐘海琳 符策崗

(1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院骨科中心，海南省海口市 570208，電子郵箱：840351452@qq.com；2 上海市第六人民醫(yī)院暨海南省海口骨科與糖尿病醫(yī)院骨科，?？谑?570000)

【提要】 骨肉瘤發(fā)病率在兒童和青少年惡性腫瘤中居首位，肺部轉(zhuǎn)移率高，僅行手術(shù)治療的患者存活率較低。免疫療法具有腫瘤免疫殺傷特異性，被認為是最有可能提高癌癥患者生存率的治療方法之一，可作為骨肉瘤新的治療方向。本文就骨惡性腫瘤的生物學(xué)特點、骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移的機制以及免疫療法的機制進行綜述。

骨肉瘤好發(fā)于15～25歲的青少年，以男性患者居多，其發(fā)病率在兒童和青少年惡性腫瘤中居首位。骨肉瘤好發(fā)于長骨干骺端、股骨遠端和脛骨近端，具有很強的侵蝕性，肺部轉(zhuǎn)移率高達20%～25%，由于缺乏高效的藥物治療，骨肉瘤一旦復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，5年存活率僅為20%[1-2]。

近年來，腫瘤免疫療法受到人們的廣泛關(guān)注，且被認為是最有可能提高癌癥患者生存率的治療方法之一。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤局部CD8+侵蝕性淋巴細胞的比例明顯高于其他肉瘤亞型，且浸潤程度與生存率呈正相關(guān)[3]。骨肉瘤基因高度不穩(wěn)定，其瘤細胞表面常表達程序性細胞死亡蛋白1配體(programmed cell death ligand 1,PD-L1)，這提示程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)/PD-L1軸的抑制劑具有潛在的治療價值[4]。此外，多種癌癥相關(guān)細胞表面蛋白可以作為抗體靶向用于腫瘤免疫治療，其中米法莫肽是目前的研究熱點之一[5]。米法莫肽是一種細菌細胞壁的類似物，可以通過活化單核細胞和巨噬細胞來刺激腫瘤免疫殺傷，從而抑制腫瘤的發(fā)展。目前，歐洲已經(jīng)批準(zhǔn)米法莫肽用于治療骨肉瘤，其臨床隨機Ⅲ期實驗已證實，在常規(guī)化療的基礎(chǔ)上增加米法莫肽能有效提高骨肉瘤患者的生存率[5]。因此，了解骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程以及免疫治療的新進展，對提高患者的存活率至關(guān)重要。本文就骨惡性腫瘤的生物學(xué)特點、骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制以及骨肉瘤免疫療法的機制進行綜述，為骨肉瘤的治療提供新思路。

1 骨惡性腫瘤的生物學(xué)特點

骨惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展主要受致癌因素和癌細胞與周圍微環(huán)境之間的相互作用的影響。普遍認為，骨惡性腫瘤的主要來源為間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)，MSC在分化期間可能發(fā)生基因突變(P53、Rb等)，這增加了MSC轉(zhuǎn)化為癌細胞的風(fēng)險，最終導(dǎo)致惡性成骨細胞或惡性軟骨細胞的出現(xiàn)。與其他非惡性同類腫瘤相比，骨肉瘤細胞和軟骨肉瘤細胞能特異性表達Runx2和Sox9[6]，甚至可以通過這種主基因的表達明確MSC癌變過程中的傾向性[7]。因此，骨肉瘤細胞可不同程度表現(xiàn)出成骨細胞分化過程中的特性，例如骨肉瘤細胞可以表達成骨細胞標(biāo)記物(堿性磷酸酶、骨鈣蛋白或骨涎蛋白)，也可以表現(xiàn)出促進類骨質(zhì)組織形成和活化細胞外基質(zhì)的能力。此外，軟骨肉瘤細胞還具有軟骨細胞的特征，可以表達軟骨細胞標(biāo)記物(如Ⅱ型膠原蛋白或聚集蛋白聚糖)，也可以產(chǎn)生軟骨基質(zhì)，將惡性軟骨細胞包裹在其中[7]。目前普遍認為，骨肉瘤和軟骨肉瘤形成的原因是由MSC分化受損所致，但尤文肉瘤的起源仍頗受爭議。實際上，尤文肉瘤細胞可特異性表達融合蛋白，該蛋白是由2號染色體上的尤文肉瘤基因和表達序列標(biāo)簽家族基因之間染色體發(fā)生易位而產(chǎn)生[8]。然而，由于尤文肉瘤在骨中的發(fā)病位置復(fù)雜，且尤文肉瘤FLI1基因在尤文肉瘤細胞中沉默，導(dǎo)致尤文肉瘤的起源難以確定[8]。目前，關(guān)于尤文肉瘤的起源存在3種假設(shè)，即神經(jīng)嵴干細胞[9]、胚胎骨軟骨祖細胞[10]和MSC[11]。已有學(xué)者對骨惡性腫瘤的發(fā)病機理等進行研究，但仍未完全闡明[12]。

2 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制

僅進行手術(shù)治療的骨肉瘤患者5年存活率不足20%，采用手術(shù)與化療聯(lián)合治療后5年存活率可提高至70%，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移(肺部轉(zhuǎn)移常見)，患者5年生存率又降低至20%[13]。因此，了解骨肉瘤從骨骼部位(原發(fā)病灶)擴散到肺組織的內(nèi)在機制，有助于預(yù)防骨肉瘤轉(zhuǎn)移或特異性殺傷轉(zhuǎn)移性病變，提高療效，改善預(yù)后[14]。目前已明確部分涉及骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機制。研究顯示，WNT/β-連環(huán)蛋白途徑在骨肉瘤原發(fā)灶中被激活并促進癌細胞的早期轉(zhuǎn)移，包括促進骨肉瘤細胞侵襲、趨化和外滲[15]，阻斷該途徑對抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移具有重要的意義[16-17]。還有研究顯示，Notch信號途徑可促進骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，γ-分泌酶抑制劑可以阻止這一類轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展[18]。此外，骨肉瘤細胞高度表達埃茲蛋白，埃茲蛋白可以將肌動蛋白細胞骨架與細胞外基質(zhì)連接起來，并作為磷脂?；?-激酶/蛋白激酶信號傳導(dǎo)的支架，促進骨肉瘤的轉(zhuǎn)移；埃茲蛋白的抑制劑具有阻斷骨肉瘤細胞侵襲并抑制轉(zhuǎn)移的作用[19]。原發(fā)病灶微環(huán)境中的一些細胞因子(間質(zhì)源性轉(zhuǎn)化生長因子β和白細胞介素6)可以通過細胞核因子κB活化因子/細胞核因子κB受體活化因子信號通路活化細胞核因子κB，發(fā)揮促進骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的作用[20]。由腫瘤細胞分泌的ΔNp63衍生物白細胞介素6和白細胞介素8可促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移并定植于肺部[17]，靶向阻斷該途徑能有效防止骨肉瘤轉(zhuǎn)移[21]，目前此途徑的臨床試劑已經(jīng)進入臨床階段。此外，許多肺部特異性代謝過程在骨肉瘤定植中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)移相關(guān)gp78的上調(diào)[22]、蛋白激酶C激活[23]或mTOR途徑激活[24]等。因此，闡明骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移過程的內(nèi)在機制，對骨肉瘤的治療和預(yù)防具有重要意義，但相關(guān)研究進展緩慢，且需要投入較大的人力和物力，目前可能還存在很多重要的途徑仍未發(fā)現(xiàn)，進一步研究已發(fā)現(xiàn)的機制和療法，或可為發(fā)現(xiàn)更有效的骨肉瘤治療方式，提高患者的生存率提供幫助。

3 腫瘤免疫療法

人類免疫系統(tǒng)是機體內(nèi)一種高度復(fù)雜的防御系統(tǒng)，由多種細胞參與并共同作用以抗擊外來的威脅(例如感染、腫瘤)，同時保持自身免疫穩(wěn)定。傳統(tǒng)化療的靶向是惡性增殖細胞，但免疫療法能準(zhǔn)確靶向到癌細胞本身，因此，與化療相比，免疫治療的針對性更強。免疫系統(tǒng)與癌癥之間的相互作用較復(fù)雜，包括免疫監(jiān)視、免疫細胞浸潤和腫瘤細胞溶解，但是腫瘤細胞可以通過釋放抑制性細胞因子和下調(diào)細胞表面標(biāo)志物的表達來抑制免疫反應(yīng)，目前將這種現(xiàn)象稱為癌癥“免疫編輯”，由消除、平衡和逃避3個不同階段組成[25]。消除主要涉及發(fā)現(xiàn)癌癥特異性抗原、形成腫瘤特異性T細胞、破壞腫瘤細胞等過程。但一些癌細胞可以在消除階段存活并進入平衡階段，進入平衡階段的癌細胞有可能適應(yīng)免疫系統(tǒng)長期的腫瘤特異性應(yīng)答，并保持休眠狀態(tài)，最后可能發(fā)生進化并實現(xiàn)免疫逃逸，從而增殖[25]。腫瘤細胞免疫逃逸的機制包括腫瘤抗原表達缺失、來自癌細胞表面的人白細胞抗原下調(diào)、調(diào)節(jié)性T細胞或腫瘤相關(guān)的M2巨噬細胞募集等，這些機制都具備免疫抑制作用，可上調(diào)T細胞上抑制性受體(如細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4、PD-1)或腫瘤細胞上抑制性配體(如PD-L1)的表達，從而抑制免疫反應(yīng)[26]。免疫療法旨在抵消這些逃逸現(xiàn)象，增強患者的免疫功能，從而識別和破壞癌細胞，其相關(guān)機制主要涉及以下幾種物質(zhì)。

3.1 針對細胞表面蛋白的抗體 骨肉瘤細胞表面存在多種抗原，這些抗原可以作為腫瘤免疫治療的靶向。已有研究證實，腫瘤免疫治療可有效治療神經(jīng)母細胞瘤，這給針對癌細胞表面蛋白的抗體靶向治療帶來了希望[25]。其原理是將單克隆抗體與腫瘤細胞表面抗原結(jié)合，并激活自然殺傷細胞和巨噬細胞釋放細胞毒性物質(zhì)，從而針對性地殺傷腫瘤細胞，這個過程也被稱為抗體依賴性細胞毒作用。此外，雙特異性T細胞鏈接器是一種含有兩個單鏈可變區(qū)基因片段的抗體，可以通過柔性接頭將T細胞上的CD3受體與腫瘤抗原緊密連接，導(dǎo)致T細胞活化并殺傷癌細胞[27-28]。將抗體與細胞毒性劑(如維多汀)鏈接在一起，也可用于癌細胞的特異性化療[29]。

3.2 腫瘤疫苗和樹突狀細胞 腫瘤疫苗包括腫瘤細胞本身、溶解產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、DNA、RNA和肽類等。腫瘤疫苗是癌癥免疫療法的早期方式之一，其原理是通過暴露(接種)腫瘤抗原誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫反應(yīng)。樹突狀細胞是抗原呈遞細胞，具有活化T細胞并引起細胞毒性T淋巴細胞增殖的能力[30]。癌癥患者體內(nèi)成熟的樹突狀細胞往往含有特異性顆粒(如腫瘤細胞裂解物)，將其離體后添加免疫佐劑然后重新注射到患者體內(nèi)，可有效增強腫瘤的免疫殺傷作用[31]。

3.3 溶瘤病毒 溶瘤病毒是由基因工程制造的一種弱化病毒，其特點是僅在惡性細胞中復(fù)制。由于溶瘤病毒不依賴于特定的腫瘤細胞抗原，因此非常適用于實體腫瘤的治療，其除了能特異性發(fā)揮腫瘤細胞的毒性作用外，還可促進腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，進一步促進抗原呈遞和抗原呈遞細胞成熟，增強了腫瘤殺傷作用[32]。

3.4 過繼性細胞療法 過繼性細胞療法是通過細胞溶解細胞刺激機體發(fā)生抗腫瘤反應(yīng)的一種免疫療法[30]，旨在抵消腫瘤細胞的各種免疫逃逸。例如，惡性腫瘤細胞可以通過下調(diào)人白細胞抗原和其他腫瘤特異性抗原，使其不被T細胞識別。為了解決這個問題，可以對T細胞進行設(shè)計，增強其對特定抗原的親和力，而不需要通過人白細胞抗原的呈遞也可以進行肽識別。這些經(jīng)過基因工程改造的T細胞被稱為嵌合抗原受體T細胞，它由細胞外結(jié)構(gòu)域(包含針對腫瘤表面特異性抗原的單克隆抗體)、間隔結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈共同組成[33]。研究發(fā)現(xiàn)，采用CD3和CD28抗體與重組白細胞介素2活化骨肉瘤患者外周血中的單核細胞，然后用編碼靶抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(如人類表皮生長因子受體2)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，再用白細胞介素2進一步擴增T細胞系，測試其免疫特異性后再回輸給患者，可增強骨肉瘤的免疫殺傷能力[27]。

過繼性細胞治療也可以選用自然殺傷細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)。自然殺傷細胞是先天免疫系統(tǒng)中的淋巴細胞，具有細胞毒性和調(diào)節(jié)功能。與T細胞和B細胞不同，自然殺傷細胞可以在沒有免疫暴露的情況下事先識別目標(biāo)。TIL是過繼性細胞療法的另一種形式，在腫瘤抗原的幫助下TIL可以高度特異性地遷移到腫瘤中，并直接殺死腫瘤細胞，同時釋放細胞因子，進一步介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)[34]。

3.5 檢查點抑制劑 由于惡性腫瘤細胞可以通過抑制檢查點配體的免疫反應(yīng)而逃避免疫監(jiān)視，在沒有經(jīng)過離體擴增的情況下，內(nèi)源性TIL通常無法完全抑制腫瘤的生長[35]。檢查點抑制劑可以重新激活T細胞介導(dǎo)的腫瘤抗原特異性反應(yīng)，并逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，其機制是通過組織相容性復(fù)合物激活機體對新抗原的反應(yīng)[28]。雖然目前尚不能證實骨肉瘤復(fù)雜的基因組和染色體的不穩(wěn)定性是否會引起基因突變，但是其高度的遺傳不穩(wěn)定性很可能產(chǎn)生新的免疫介導(dǎo)殺傷基質(zhì)表位，從而增強檢查點抑制劑(如細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4、PD-1和PD-L1的抑制劑)用于腫瘤治療的潛力[36-37]。

細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4是在調(diào)節(jié)性T細胞和記憶T細胞上表達的跨膜糖蛋白受體，在與樹突狀細胞上的CD80/86鏈接后可以抑制免疫功能[36]。與健康人相比，骨肉瘤患者的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4表達增加，因此人們提出，細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4抑制劑可以用于骨肉瘤的治療[38]。PD-1是在T細胞上表達的另一種跨膜免疫球蛋白家族成員，其在慢性活化的T細胞中表達最高[39]，PD-1是免疫系統(tǒng)的“剎車”，可以抑制細胞毒性T淋巴細胞并激活Treg細胞，且重要的是，其配體(PD-L1)在骨肉瘤腫瘤細胞和免疫細胞表面均有表達[37]。

4 小 結(jié)

免疫療法為骨肉瘤的治療帶來了新的曙光，目前已有學(xué)者致力于研究各種免疫療法應(yīng)用于腫瘤治療的效果和新藥物的研發(fā)。然而，由于免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性和腫瘤特異性微環(huán)境的細微差別，且腫瘤本身也會通過多種途徑抵抗免疫療法，使得免疫療法在骨肉瘤中的應(yīng)用研究進展緩慢。進一步闡明現(xiàn)有免疫療法的抵抗機制，開發(fā)和測試合理的聯(lián)合療法(手術(shù)+化療+抗轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)+免疫療法)對提高骨肉瘤的治療效果和患者的生存率至關(guān)重要，免疫療法有望成為骨肉瘤治療的新突破。