心臟移植物血管病中NF-κB通路對血管平滑肌細胞的影響

張鵬， 張松林

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、宜昌市中心人民醫(yī)院心血管外科(湖北宜昌 443002)

心臟移植已經(jīng)成為選擇性治療終末期心力衰竭患者的標(biāo)準(zhǔn)[1]，而心臟移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy,CAV)仍然是制約心臟移植后長期存活的致命弱點。幾乎1/3的患者在移植后的5年發(fā)展成CAV，1/8患者在1年內(nèi)的死因是由于CAV[2]。CAV的發(fā)病機制尚不明確，主要是固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)，其他因素主要包括：急性排斥反應(yīng)，缺血-再灌注損傷，巨細胞病毒感染等[3-4]。綜合因素的作用最終導(dǎo)致冠狀動脈閉塞性狹窄，心臟微脈管系統(tǒng)彌漫性同心圓樣內(nèi)膜增厚[5]，其進展主要表現(xiàn)為:(1)單核炎癥細胞在內(nèi)膜的浸潤；(2)單核細胞的浸潤聯(lián)合血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)以及疏松的結(jié)締組織;(3)形成不伴有明顯炎癥細胞浸潤的致密結(jié)締組織[6]。其中新生內(nèi)膜平滑肌細胞的增殖和遷移起重要的作用[7]。目前CAV并沒有特效的藥物治療，而且免疫抑制劑的長期使用不良反應(yīng)顯著，所以在免疫抑制劑的基礎(chǔ)上，更多研究轉(zhuǎn)向了免疫調(diào)節(jié)對CAV的影響中[1，7]。核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途徑是經(jīng)典的促炎信號途徑，其調(diào)控著促炎細胞因子的產(chǎn)生、白細胞的招募和細胞生存，對促進炎癥反應(yīng)具有重要作用[8]。NF-κB二聚體結(jié)合于IκB位點通過招募共激活和共抑制因子在靶基因的啟動子/增強子內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄[9]。靜息狀態(tài)下，NF-κB的P65亞基與其抑制因子IκB結(jié)合成復(fù)合物存在于胞質(zhì)中，在缺血缺氧，機械損傷和氧化應(yīng)激等條件下,NF-κB轉(zhuǎn)移到胞核中與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄基因結(jié)合，參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，自由基損傷等病理過程。NF-κB同樣參與了移植物血管病的病情發(fā)展[10]，而平滑肌細胞是血管新生內(nèi)膜的主要組成部分，對移植物血管的腔內(nèi)閉塞至關(guān)重要[11]。本文將總結(jié)NF-κB信號途徑下血管平滑肌細胞在CAV進展中的作用，為進一步理解CAV的發(fā)病機制和治療靶點提供實驗理論依據(jù)。

1 平滑肌細胞(SMCs)的來源

CAV內(nèi)膜細胞中以SMCs為主，據(jù)研究其有不同來源：(1)內(nèi)膜，SMCs的單純增殖；(2)中膜，SMCs的遷移；(3)祖細胞存在于中膜/外膜的邊界；(4)循環(huán)宿主細胞，被招募到血管損傷部位，而且新生的內(nèi)膜SMCs與中膜SMCs相比有不同的表型[12]。在嚙齒類動物模型中，移植物血管損傷的病變結(jié)果常常是由宿主來源的SMCs增殖所組成，而人的CAV病變中SMCs主要為供體來源[3]。Amano等[13]通過微型豬建立的CAV模型中，以雌性為供體雄性為受體，利用熒光原位雜交分析發(fā)現(xiàn)，增殖的細胞主要為1號染色體DNA探針，很少有Y染色體探針，進而得出增殖的SMCs主要來源于供體，并且通過鑒別增厚內(nèi)膜的標(biāo)記物α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和平滑肌肌球蛋白重鏈胚胎型(SMemb)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜SMCs增殖類型主要為胚系/分泌性類型。Atkinson等[14]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，在性別錯配組中(男性為受體，女性為供體)，平滑肌肌動蛋白染色及Y探針染色在中膜或外膜SMCs中未見雙重染色，而新生內(nèi)膜中的SMCs也呈Y-探針染色陰性，這些表明SMCs是來源于供體自身的，而循環(huán)祖細胞在人類移植CAV的新內(nèi)膜中似乎沒有發(fā)揮作用。

2 NF-κB信號的激活因素

2.1 高血壓 在自發(fā)性高血壓大鼠模型中，Sun等[15]發(fā)現(xiàn)，VSMC胞核中的p65-NF-κB水平和NF-κB熒光素酶報告基因有所增加，而p65-NF-κB結(jié)合到NLRP3(核苷酸結(jié)合的寡聚域樣受體蛋白3)啟動子同樣增高，NLRP3激活下，VSMC的合成蛋白骨橋蛋白(osteopontin,OPN)有所增高，而收縮蛋白如α-SMA和SM22α有所降低，而在NF-κB抑制劑BAY11-7082 下可明顯緩解以上VSMC類型的轉(zhuǎn)變，并可降低增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達，抑制VSMC的增殖。這說明在自發(fā)性高血壓因素影響下，通過激活NF-κB途徑可增加VSMC表型的轉(zhuǎn)變和細胞的增殖。

2.2 糖尿病 Di等[16]在研究2型糖尿病中，發(fā)現(xiàn)在晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)作用下，p65-NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，IκBα也同時減少，SMC收縮標(biāo)記α-actin和MYH11明顯降低，而用PDTC阻斷NF-κB途徑可抑制SMC收縮標(biāo)記和心肌素的減少，這說明在AGE的影響下，通過NF-κB途徑可影響SMC表型的轉(zhuǎn)變。

2.3 吸煙 Wang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，香煙中的主要成分尼古丁可誘導(dǎo)VSMC高表達活性氧(reactive oxygen species,ROS)并且增加p65和IκBα的磷酸化水平進而激活NF-κB途徑，而利用ROS清除劑可穩(wěn)定氧化應(yīng)激下的α-SMA和SM22α的表達水平，降低VSMC遷移能力；同樣用選擇性IκBα磷酸化-NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082可提高α-SMA和SM22Α的表達，降低OPN水平，從而逆轉(zhuǎn)了VSMC的類型轉(zhuǎn)變。可見ROS/NF-κB信號途徑在尼古丁誘導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)變和遷移中有重要作用。

同樣,Lu等[18]試驗中，發(fā)現(xiàn)血小板源性生長因子-BB(platelet derived growth factor,PDGF-BB)培養(yǎng)下的VSMC可增加超氧陰離子的表達，促進p65-NF-κB從胞質(zhì)到胞核的轉(zhuǎn)移和IκBα的磷酸化，而利用ROS清除劑后可明顯緩解VSMC收縮基因α-SMA的減少和合成性基因OPN的增加，而這與NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082的作用相同，并且增殖標(biāo)記如PCNA, 細胞周期蛋白D1和P27有所恢復(fù)。其闡明了PDGF-BB誘導(dǎo)下ROS/NF-κB通路在VSMC的類型轉(zhuǎn)變、增殖和遷移中的作用。

2.4 血脂異常 Kang等[19]通過球囊損傷后血管蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白受體1(oxidized LDL receptor-1,OLR1)在VSMC增殖和遷移中的雙重作用。利用最低限度氧化低密度脂蛋白可誘導(dǎo)磷酸化依賴性IκBα的減退，增加了NF-κB與DNA的結(jié)合活性，而阻斷OLR1可抑制NF-κB的活化和ICAM依賴性單核細胞對VSMC的黏附作用；損耗或消除OLR1也可使PDGFRβ的激活受損，從而影響PDGF對VSMC的增殖作用，揭示出OLR1為PDGFRβ的潛在共受體并在VSMC中協(xié)調(diào)生長信號和炎癥反應(yīng)。這進一步顯示出NF-κB信號通路在VSCMs增生中的重要作用。

2.5 其他因素 如高磷酸鹽可通過toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)激活NF-κB途徑，釋放炎癥因子如白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，參與了VSMCs的炎癥反應(yīng)和合成/分泌型細胞的轉(zhuǎn)變[20]；同樣在慢性阻塞性肺疾病鼠模型中，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞高表達TLR4，通過NF-κB途徑的活化，表達炎癥因子γ干擾素(IFN-γ)參與了炎癥反應(yīng)和血管平滑肌的重塑[21]；而在球囊損傷試驗中，動脈新生內(nèi)膜的增厚與高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB-1)和NF-κB的表達量具有時間依從性，HMGB-1可由壞死細胞、內(nèi)毒素(LPS)、IL-1和TNF-α激活的單核巨噬細胞和樹突狀細胞分泌，結(jié)合于toll樣受體同樣參與了NF-κB途徑的激活，在內(nèi)膜增生中調(diào)節(jié)著炎癥和免疫反應(yīng)[22]；生存素可能作為NF-κB的下游基因，在球囊損傷試驗中對VSMC的增殖和類型轉(zhuǎn)變有明顯的促進作用，而NF-κB的激活在其中扮演著重要角色[23]。

3 NF-κB信號抑制

3.1 轉(zhuǎn)錄因子誘惑物 將轉(zhuǎn)錄因子誘惑物(transcription factor decoy,TFD)轉(zhuǎn)染細胞可競爭性抑制NF-κB與啟動子的結(jié)合，受抑制的NF-κB可減少細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)和內(nèi)皮細胞-白細胞黏附分子-1(ELAM-1)的mRNA的表達水平，減少再灌注損傷、急性和慢性排斥反應(yīng)，適度延長移植物存活時間并可顯著減少冠狀動脈疾病，可見心臟移植后，及時阻斷NF-κB可改善心臟移植后的預(yù)后[24]。

3.2 基因轉(zhuǎn)染 用轉(zhuǎn)基因鼠使內(nèi)皮細胞表達顯性抑制IκBα(E-DNIκB mice)，在袖套股動脈損傷中，可顯著降低炎癥因子如單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、TNF-α、IL-1β和IL-6，以及SMC增殖相關(guān)因子如血小板源性生長因子-B(platelet-derived growth factor-B, PDGFB)的表達，抑制了動脈損傷的炎癥反應(yīng)和SMC的增殖效應(yīng)[25]。

3.3 二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC) 在異位心臟移植鼠模型中，與環(huán)孢霉素A組相比，NF-κB抑制劑PDTC組的移植物存活時間更長，炎癥細胞的浸潤和心肌纖維化水平也較輕，MCP-1表達水平也顯著降低，而且MCP-1可作為反映心臟移植物排斥嚴(yán)重程度的指標(biāo)，在NF-κB阻斷的心臟排斥反應(yīng)中具有重要作用[26]。

4 MicroRNA與NF-κB

微小RNAs(micro RNAs, miRNAs)是內(nèi)源性18～24個核苷酸長的非編碼RNAs,它們結(jié)合與靶向mRNA的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’UTR)誘導(dǎo)其降解或抑制轉(zhuǎn)錄，在細胞的增殖、遷移和凋亡中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

4.1 miR-155 Park等[27]給予人動脈平滑肌細胞TNF-α后，發(fā)現(xiàn)其中miR-155的生物合成以時間依賴的方式顯著增加，而NF-κB抑制劑Bay11-7082可阻斷其增加效應(yīng)。NF-κB依賴的miR-155對誘導(dǎo)性NO合酶(iNOS)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，而NO 可激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶/環(huán)磷酸鳥苷(sGC/cGMP)信號通路，其在維持VSMC的舒張、增殖和類型轉(zhuǎn)變中具有重要作用，其結(jié)果表明NF-κB依賴的miR-155的增加可使sGC/cGMP通路受損，促進VSMC的類型轉(zhuǎn)變和增殖。

另一項研究同樣發(fā)現(xiàn)TNF-α下的人和鼠動脈平滑肌的表型從收縮型向合成分泌型的轉(zhuǎn)變，而miR-155-5p抑制劑下，可明顯抑制VSMC的增殖、遷移和類型的轉(zhuǎn)變，NF-κB抑制劑Bay11-7082也可阻止收縮型標(biāo)記基因α-SMA、SM22a、MHC11的下降。其作用機制可能為TNF-α下NF-κB反應(yīng)性miR-155-5p水平增高，可負(fù)性調(diào)節(jié)環(huán)磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶1(cGMP-dependent protein kinase1,PKG1)，從而損傷NO/cGMP通路介導(dǎo)的VSMC收縮表型和血管松弛的維持，并促進VSMC的增殖和遷移[28]。

4.2 miR-17 Yang等[29]研究表明miR-17的表達可增加VSMC中PCNA和E2F1水平，通過加強G1/S期的過渡，促進細胞周期的進展，刺激了VSMC增殖。而NF-κB p65信號的活化可顯著增加miR-17在VSMC中的水平，并降低了視網(wǎng)膜母細胞瘤RB基因的表達(retinoblastoma,RB)，miR-17抑制劑則可消除對RB的抑制。NF-κB p65亞基可結(jié)合于miR-17的啟動子，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄；而miR-17可靶向結(jié)合于RB蛋白mRNA-3′非翻譯區(qū)，抑制其基因的表達，促進細胞的增殖，從而表明了NF-κB p65/miR-17/RB通路在VSMC增殖中的重要作用。

4.3 miR-27a/b 劑量和時間依賴下的內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)可導(dǎo)致鼠肺動脈平滑肌細胞的過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)表達下降和細胞的增殖，而增高的miR-27a/b可直接結(jié)合于PPARγ mRNA的3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)，控制SMC的增殖。增高的miR-27a/b受NF-κB調(diào)控(結(jié)合于miR-27a/b啟動子區(qū)域)，在內(nèi)皮素-1的影響下，下調(diào)PPARγ表達水平，促進SMC的增殖。這表明NF-κB信號的活化可增強miR-27a/b的表達，從而下調(diào)PPARγ并促進SMC的增殖[30]。

5 NF-κB通路的調(diào)節(jié)

5.1 miR-132/212 Kong等[31]研究發(fā)現(xiàn)，獨立于IκBα的磷酸化和降解，胞質(zhì)中的環(huán)形RNA-沉默調(diào)節(jié)蛋白1(circular RNA-sirtuins-1,circ-Sirt1)可形成circ-Sirt1-NF-κB p65失活復(fù)合物，從而阻止NF-κB p65向胞核的轉(zhuǎn)移，或通過競爭性結(jié)合miR-132/212促進了SIRT1基因(silent information regulator transcript-1)的表達，使NF-κB p65去乙酰化而失活。circ-Sirt1在人和大鼠新內(nèi)膜增生及VSMC病理刺激下表達水平降低。通過病毒載體轉(zhuǎn)染，TNF-α可誘導(dǎo)人腎動脈平滑肌細胞表達外生性circ-Sirt1， 降低了VCAM-1、ICAM-1和MCP-1 mRNA表達水平，而circ-Sirt1過表達可抑制VSMC的炎癥表型轉(zhuǎn)換(人和鼠體內(nèi)外)，改善損傷性血管炎癥和新生內(nèi)膜的形成。可見circ-Sirt1可調(diào)節(jié)NF-κB在胞質(zhì)和胞核中的活化，具有協(xié)同抗炎和抑制VSMC表型轉(zhuǎn)變的作用。

在PDGF-BB作用下，VSMCs中的miR-29b表達量增加并伴隨其分化相關(guān)基因的表達降低如α-SMA、SM-MHC和Sirt1，促進了VSMC的表型轉(zhuǎn)變。而miR-29b抑制劑增加了VSMC分化標(biāo)志物基因的表達，并且加強了NF-κB的活化。Sirt1敲低部分逆轉(zhuǎn)了這些基因的表達，并且miR-29b能可逆地調(diào)節(jié)Sirt1蛋白水平，這表明miR-29b可通過抑制Sirt1/NF-κB途徑調(diào)控VSMC的表型轉(zhuǎn)變[32]。

5.2 miR-30e 泛素結(jié)合酶E2I (ubiquitin-conjugating enzyme E2I,Ube2i) 可通過修飾關(guān)鍵酶從而抑制靶蛋白的降解，在很多過程中對維持和調(diào)節(jié)靶蛋白水平具有重要作用。Zong等[33]的研究中發(fā)現(xiàn)miR-30e在調(diào)控VSMC的增殖、遷移、分化和凋亡中扮演著重要角色。增殖和遷移的VSMCs中miR-30e表達水平降低，而Ube2i蛋白和NF-κB水平增高；通過熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Ube2i為內(nèi)源性miR-30e的靶基因，而Ube2i可促進IκBα的降解，激活NF-κB信號通路。miR-30e通過與Ube2i的靶向結(jié)合，并下調(diào)IκBα/NF-κB信號通路，在抑制VSMC的增殖、遷移和促進凋亡中具有重要作用。

6 總結(jié)與展望

盡管過去30年中免疫抑制有所改善，但CAV發(fā)生率并沒有顯著下降，并且它的進展仍然限制著心臟移植患者的長期存活。

綜上所述，NF-κB作為促炎信號分子在血管平滑肌細胞的增殖和遷移中具有重要作用，CAV中的多種危險因素如高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、氧化應(yīng)激等都可激活NF-κB信號通路。激活的NF-κB轉(zhuǎn)移到胞核，通過誘導(dǎo)黏附分子和炎癥因子的表達，促進VSMC的增殖、遷移和表型的轉(zhuǎn)變。各種抑制NF-κB通路的方法都可降低ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1的表達，阻止VSMCs收縮性標(biāo)記α-SMA、SM22a的下降，從而逆轉(zhuǎn)了NF-κB激活引起的血管平滑肌細胞的增殖，遷移和表型轉(zhuǎn)變。MiRNA在細胞的增殖、遷移和凋亡中具有重要的調(diào)節(jié)作用，如與NF-κB信號相關(guān)的miR-155、miR-155-5p、miR-17、miR-27a/b可通過不同機制參與VSMC的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換；而miR-132/212、miR-29b和miR-30e可分別通過Sirt1/NF-κB、Ube2i/IκBα/NF-κB通路機制調(diào)控NF-κB的活性，參與了VSMC的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換?？梢奛F-κB信號途徑對VSMC的病理變化具有重要促進作用，在CAV的早期和慢性炎癥反應(yīng)中促進CAV的發(fā)展，其可作為免疫抑制劑的輔助作用靶點，從而改善CAV進展，延長移植物存活時間。