西藏溫泉兩種中國新記錄纖毛蟲第一雙小核草履蟲和明布雷斯四膜蟲的形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究

姜傳奇 谷思雨 安瑞志 巴 桑* 繆 煒*

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 哈爾濱師范大學(xué)黑龍江省水生生物多樣性研究重點實驗室, 哈爾濱 150025; 3. 西藏大學(xué)理學(xué)院濕地與流域生態(tài)實驗室, 拉薩 850000)

纖毛蟲隸屬原生生物界, 原生動物亞界, 是較復(fù)雜的單細胞真核生物。纖毛蟲物種豐富, 已記載8000余種, 廣泛分布于淡水、海水、土壤甚至一些極端環(huán)境中[1]。青藏高原是“世界屋脊”, 有著獨特的自然環(huán)境和豐富的生物資源。其中, 西藏地區(qū)地?zé)豳Y源非常豐富, 各種地?zé)犸@示遍布全區(qū)。1966年和1973—1976年, 王家楫等在第一次青藏高原綜合科學(xué)考察中采集了大量的無脊椎動物標(biāo)本, 隨后完成的《西藏高原部分地區(qū)的原生動物》、《珠穆朗瑪峰地區(qū)的原生動物》、《西藏水生無脊椎動物》共記述了西藏地區(qū)原生動物458種, 其中纖毛蟲288種[2—4]。期間, 也對部分溫泉的原生動物進行調(diào)查, 共鑒定到原生動物52種, 其中纖毛蟲有13種[4]。近年來, 隨著纖毛蟲培養(yǎng)技術(shù)和研究手段的逐步發(fā)展完善, 可以對西藏溫泉生境該類群的生物資源開展更深入和系統(tǒng)的研究。

本研究對位于西藏地區(qū)的日多溫泉和羊八井溫泉進行樣品采集, 鑒定得到了兩種寡膜綱纖毛蟲中國新記錄種： 咽膜類的第一雙小核草履蟲(Para-mecium primaurelia)和膜口類的明布雷斯四膜蟲(Tetrahymena mimbres)。本研究詳細描述了這兩種纖毛蟲的形態(tài)學(xué)特征, 測定了它們的SSU rDNA和COXⅠ基因序列并基于這兩種分子標(biāo)記進行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

兩種纖毛蟲第一雙小核草履蟲和明布雷斯四膜蟲于2018年10月采自西藏高原, 其中P. primaurelia采自拉薩市墨竹工卡縣的日多溫泉(N 29°41′,E 92°14′; 海拔： 4365 m; 水溫： 50—60℃),T. mimbres采自當(dāng)雄縣的羊八井溫泉(N 29°58′, E 90°21′; 海拔：4350 m; 水溫： 43℃)。使用采樣瓶收集溫泉原位水及懸浮物。樣品采集后, 在實驗室將不同采集地點的水樣搖勻分別倒入培養(yǎng)皿中, 每個培養(yǎng)皿加入兩粒已滅菌的麥粒, 將培養(yǎng)皿蓋好蓋子分別放入封閉樣品盒內(nèi)以避免樣品交叉污染。培養(yǎng)4—5d后, 在解剖鏡(ZEISS Stemi2000-C)下, 利用微吸管分離單克隆株系, 并使用過濾(濾膜規(guī)格： 0.22 μm)原位水加入滅菌麥粒于25℃擴大培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)學(xué)研究

在解剖鏡下利用微吸管挑取少量纖毛蟲于載玻片上進行活體壓片, 在顯微鏡下(100×—1000×)觀察蟲體的大小、顏色、形狀、運動方式和伸縮泡等活體特征。采用蛋白銀染色法[5]和氨銀染色法[6]制片, 分別獲得P. primaurelia和T. mimbres的纖毛圖式和核器特征等。此外, 細胞核的形態(tài)還以2%多聚甲醛(PFA)固定細胞, 經(jīng)0.5 μg/mL DAPI(4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚)核酸染料染色,在熒光顯微鏡下觀察。顯微觀察及拍照利用尼康顯微鏡(Nikon EC-LIPSE 80i)。系統(tǒng)分類和術(shù)語依據(jù)Lynn(2008)。

1.3 DNA提取和PCR擴增

第一雙小核草履蟲(P. primaurelia)和明布雷斯四膜蟲(T. mimbres)的DNA提取利用REDExtract-NAmpTMPCR試劑盒, 利用微吸管分別挑取少量的T. mimbres和P. primaurelia細胞, 經(jīng)蒸餾水清洗數(shù)次后, 放入PCR管中, 按照試劑盒說明書操作, 釋放總DNA(www.sigmaaldrich.com)。兩種纖毛蟲SSU rDNA序列的擴增利用真核生物通用引物18S-F： 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′和18S-R： 5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′[7];P.primaurelia COXⅠ基因的擴增利用引物F199dT-B：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTTCAGGWGCT GCMTTAGCHACYATG-3′和R1143dT： 5′-CAG GAAACAGCTATGACTARTATAGGATCMCCW CCATAAGC-3′;T. mimbresCOXⅠ基因的擴增利用引物F298dT： 5′-TGTAAAACGACGGCCAGT GCNCAYGGTYTAATNATGGT-3′和R1184dT： 5′-CAGGAAACAGCTATGACTADACYTCAGG GTGACCRAAAAATCA-3′[8]。PCR后, 擴增產(chǎn)物直接送測序公司測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

除新測序列外, 其余序列均來自GenBank數(shù)據(jù)庫, 包括109條SSU rDNA基因序列和112條COXⅠ基因序列(序列信息詳見圖版Ⅰ、圖版Ⅱ)。選擇七種盾纖類纖毛蟲(Pseudocohnilembus persalinus、Pseudocohnilembus longisetus、Philasterides dicentrarchi、Miamiensis avidus、Cyclidium glaucoma、Entodiscus borealis、Plagiopyliella pacifica)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列比對利用MEGA 6.0中的Muscle程序[9], 比對完成后, 兩端截平并手動刪除無法明確比對的模糊區(qū)域。最大似然樹(ML)的構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件, 選擇GTR+I+G最優(yōu)模型, 節(jié)點置信值來自1000疊代重復(fù)抽樣[9]。貝葉斯樹(BI)利用MrBays 3.2.1軟件構(gòu)建, 選擇GTR+I+G最優(yōu)模型[10], MCMC模擬運行10000000代, 每100代取樣1次, 前10000棵樹舍棄, 剩余的樹用來計算后驗概率。使用MEGA 6.0軟件調(diào)整樹形[9]。

2 結(jié)果

2.1 第一雙小核草履蟲的形態(tài)學(xué)描述(圖版 Ⅰ, 表1)

活體約(150—200) μm × (60—100) μm, 腹面觀為長橢圓形或足形, 前端略尖, 具有明顯的斜截區(qū),后端口區(qū)以下逐漸變窄, 蟲體不對稱(圖版 Ⅰ-A、E—I)。口區(qū)位于蟲體腹面中部(圖版 Ⅰ-A、F、G、N)。蟲體淺灰色, 體內(nèi)充滿內(nèi)含物, 包括食物顆粒、晶體和食物泡等(圖版 Ⅰ-A、E—I)。大核一個, 橢圓形, 位于蟲體中部, 約40 μm; 小核兩枚,靠近大核, 約2 μm (圖版 Ⅰ-A、R)。伸縮泡兩個,分別于蟲體前端和后端(圖版 Ⅰ-A、H)。體纖毛整齊, 長約6 μm; 約十根尾纖毛聚集呈簇, 位于蟲體尾部, 長約15 μm (圖版 Ⅰ-I)。運動方式為沿身體長軸旋轉(zhuǎn)前進, 不時在水中快速自由穿梭。

表1 第一雙小核草履蟲的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)Tab. 1 Morphometric data of Paramecium primaurelia

體動基列60—80列(圖版 Ⅰ-B, C, J, K), 口前和口后縫合線明顯, 口前縫合線從蟲體頂端延至體中部胞口處, 口后縫合線從口區(qū)底端延伸至尾部(圖版 Ⅰ-B、K—M)?？谄骶哂袑俚湫吞卣鳎?由三片小膜(P1、P2、P3)和一片口側(cè)膜(PM)組成。三片小膜均由四列毛基列組成, P1四列毛基粒分散, P1長于P2, P3最短(圖版 Ⅰ-D、O—Q)。

2.2 明布雷斯四膜蟲(Tetrahymena mimbres)的形態(tài)學(xué)描述(圖版 Ⅱ, 表2)

活體約(35—50) μm × (15—25) μm, 呈卵圓形,前端稍尖, 后端鈍圓(圖版 Ⅱ-A、E—H), 長寬比約2﹕1。口區(qū)較小, 位于體前端1/4處, 約占體長的1/5—1/6。口纖毛長6—7 μm; 體纖毛密集排列, 長4—5 μm (圖版 Ⅱ-A、F—H)。細胞質(zhì)無色至灰白色, 含有數(shù)個隨機分布的充滿細菌的食物泡(直徑約3 μm, 圖版 Ⅱ-A、E—H)。大核一個, 球形或卵圓形, 直徑約10 μm, 位于體中部, 無小核(圖版 Ⅱ-I)。伸縮泡一個, 位于體后部, 直徑約6 μm, 伸縮周期約1min (圖版Ⅱ-A、H)。

體動基列16—18列, 縱向排列, 靠近蟲體頂部毛基粒密集, 蟲體后部較稀疏(圖版 Ⅱ-B、C、J—N)?？趨^(qū)前有明顯縫合線, 由口區(qū)前端延伸至蟲體頂端無毛區(qū)(圖版 Ⅱ-B、J、M)?？诤髣踊?PK)兩列, 口后動基列1 (PK1)開始于口側(cè)膜中間位置, 向后延伸至細胞末端; 口后動基列2(PK2)開始于口側(cè)膜底部, 延伸至蟲體末端(圖版 Ⅱ-B、J)?？谇豢v軸與體軸平行, 口區(qū)內(nèi)為典型的“四膜”式構(gòu)造, 包括三片口區(qū)小膜(M1、M2、M3)及一片口側(cè)膜(PM)。M1略長于M2, M1與M2近乎平行, 均由三列平行的毛基粒構(gòu)成; M3較短, 形狀近似圓形?？趥?cè)膜起始于M2前端, 圍繞三片小膜邊緣至口區(qū)底部(圖版 Ⅱ-D、O)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

本研究兩種纖毛蟲的SSU rDNA和COXⅠ基因序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫, 其中P. primaurelia的SSU rDNA序列(序列號： MK579298, 長度1649個堿基, GC含量43%)與GenBank中該種的序列(MG573196和MG573195)的相似度為100%、99%;其COXⅠ基因序列(序列號： MK715448, 長度859個堿基, GC含量41%)與GenBank中該種的序列(FN421324和FJ905141)相似度均為99%。T.mimbres的SSU rDNA序列(序列號： MK579316, 長度1655個堿基, GC含量43%)與GenBank中該種(EF070251)的相似度為99%; 其COXⅠ基因序列(序列號： MK715449, 長度876個堿基, GC含量27%)與GenBank該種的序列(EF070292)的相似度為99%。

本研究選擇GenBank數(shù)據(jù)庫中有SSU rDNA序列信息的38種四膜蟲(46條序列)、20種草履蟲(56條序列), 以寡膜綱七種盾纖類纖毛蟲作為外類群構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示： (1)草履蟲科單系。(2)新測序的西藏溫泉種P. primaurelia與來自GenBank數(shù)據(jù)庫中的四個P. primaurelia種群(MG573194、MG573195、MG573196和AF100 315)聚為一枝, 聚在Paramecium aurelia復(fù)合種(P.aureliacomplex)內(nèi)。(3)四膜蟲科單系, 包括兩個主要類群：T. borealis類群(T. borealisgroup)和T. australis類群(T. australisgroup); (4)新測序的西藏溫泉種T. mimbres與GenBank的T. mimbres(EF070251)聚為一枝, 與T. elliotti(EF070246)聚為姐妹枝, 聚在T. borealis類群中。

COXⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹利用GenBank數(shù)據(jù)庫中四膜蟲的57條和草履蟲的48條序列, 以盾纖類纖毛蟲為外類群構(gòu)建(圖2)。結(jié)果顯示： (1)本研究新測序的P. primaurelia與GenBank中11種P. primaurelia種群均聚為一枝, 聚在P. aurelia復(fù)合種(P. aureliacomplex)中。(2)本次新測序的T. mimbres與Gen-Bank中T. mimbres(EF070292)聚為一枝, 與T.elliotti(EF079281)聚為姐妹枝, 共同聚在T. borealis類群中。

表2 明布雷斯四膜蟲的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)Tab. 2 Morphometric data of Tetrahymena mimbres

圖1 基于核糖體小亞基基因序列構(gòu)建的最大似然樹Fig. 1 Maximum likelihood (ML) tree based on small subunit ribosomal DNA sequences

圖2 基于線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ基因序列構(gòu)建的最大似然樹Fig. 2 Maximum likelihood (ML) tree based on cytochrome oxidase subunit Ⅰgene sequences

3 討論

第一雙小核草履蟲(Paramecium primaurelia)由Sonneborn于1975年命名, 屬于P. aurelia復(fù)合種[11]。Gill和Hanson(1968)、Hufnagel(1969)和Sonneborn(1975)對P. aurelia復(fù)合種進行了形態(tài)學(xué)研究,P.primaurelia西藏種群符合P. aurelia復(fù)合種的形態(tài)學(xué)特征(蟲體雪茄狀, 體長80—200 μm, 是體寬的3—4倍; 伸縮泡兩枚; 大核一枚、小核兩枚; 體動基列60—80列、口區(qū)結(jié)構(gòu)、前后縫合線等)[11—13]。本研究利用活體觀察、蛋白銀、DAPI染色法, 補充了該種活體特征、細胞核的形態(tài)和位置、纖毛圖式和口區(qū)三片咽膜及口側(cè)膜的排布模式, 并提供了該種西藏溫泉種群的SSU rDNA基因和COXⅠ基因序列信息。這兩種分子標(biāo)記基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析均支持P. primaurelia與GenBank中已發(fā)表的P.primaurelia種群聚為一枝, 聚在P. aurelia復(fù)合種中,與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。

明布雷斯四膜蟲(Tetrahymena mimbres)最早將其認定為Tetrahymena pyriformis復(fù)合種中的NT-1株系[14], 于1987年由Meyer和Nanney將其更名為T.mimbres[15]。目前, 關(guān)于該種的研究較少, 無形態(tài)學(xué)方面的研究。本研究對該種活體形態(tài)、細胞核的形態(tài)和位置、體纖毛圖式和三片口區(qū)小膜及口側(cè)膜的排布模式進行了詳細的描述, 并提供了該種西藏溫泉種群的SSU rDNA和COXⅠ基因序列信息,系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析支持該種聚在T. borealis種群內(nèi)部,與T. elliotti的親緣關(guān)系較近。

利用采樣瓶收集西藏溫泉原位水及懸浮物, 置于實驗室中封閉培養(yǎng), 并在解剖鏡下利用微吸管分離單克隆株系, 進一步培養(yǎng)獲得了兩種中國新記錄纖毛蟲。其中,P. primaurelia為廣布種, 在美洲的南部、北部、中部, 歐洲的俄羅斯、馬爾他、保加利亞, 非洲的納塔爾, 亞洲的日本、緬甸等地均有報道[16—20], 顯示出其較強的環(huán)境適應(yīng)性; 首次在西藏日多溫泉中的發(fā)現(xiàn), 表明該種還具有較強的高原和高溫適應(yīng)性。T. mimbres的首次發(fā)現(xiàn)是在美國新墨西哥州的溫泉(Mimbres hot springs)[21], 之后在美國德克薩斯州的溫泉中也有報道[22], 表明該種為喜高溫種類, 具有明顯的高溫適應(yīng)性。T. mimbres首次在西藏羊八井溫泉中的發(fā)現(xiàn), 也體現(xiàn)出該種有較強的高原適應(yīng)性。本研究借助纖毛蟲培養(yǎng)技術(shù)和形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)研究手段, 鑒定出西藏溫泉的兩種中國新記錄纖毛蟲, 為西藏溫泉原生動物生物資源的發(fā)掘提供新的方法和思路, 也為原生動物環(huán)境適應(yīng)性研究提供基礎(chǔ)性資料。

圖版Ⅰ 第一雙小核草履蟲的形態(tài)學(xué)特征PlateⅠ Morphology of Paramecium primaurelia

圖版Ⅱ 明布雷斯四膜蟲的形態(tài)學(xué)特征PlateⅡ Morphology of Tetrahymena mimbres