金魚藻對鹽堿脅迫的生理響應研究

龍憶年 魯 汭 王 培 林莉莉 陳宇華 肖恩榮 吳振斌

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072;2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 武漢理工大學, 武漢 430070)

莫莫格國家級自然保護區(qū), 位于吉林省鎮(zhèn)賚縣東部, 是以白鶴等珍稀水禽棲息地為主要保護對象的內(nèi)陸濕地和水域生態(tài)系統(tǒng)保護區(qū)[1], 其中白鶴湖(俗稱鵝頭泡)是白鶴遷徙途中重要的棲息場所, 也是莫莫格濕地保護區(qū)內(nèi)的代表性湖泊。白鶴湖水體pH常年高于8.0, 屬于HCO3-Na型水體, 呈現(xiàn)鹽堿化特征[2], 尤其在枯水期, 沿湖帶隨處可見析出的白色鹽分。周邊的農(nóng)田退水排入保護區(qū)內(nèi)濕地, 進一步匯入白鶴湖中, 使得湖體鹽堿化同時, 也伴隨著極大的富營養(yǎng)化風險。根據(jù)近兩年初步調查, 白鶴湖中現(xiàn)存的沉水植物種類稀少, 生物量相對較高的僅有篦齒眼子菜(Potamogeton pectinatus)、金魚藻(Ceratophyllum demersum)、黃花貍藻(Utricularia aurea)等, 且主要分布在風浪較小、水流流速較小、且周圍挺水植物相對較多的幾個區(qū)域。

沉水植物作為主要生產(chǎn)者, 具有為魚蝦等水生生物提供食物及棲息地, 提高水體自凈能力和透明度等生態(tài)功能, 在湖泊生態(tài)平衡及生物多樣性中起著不可或缺的作用。雖然目前關于植被耐鹽堿的研究已有許多, 但大部分集中在挺水植物如扁稈藨草[3]、互花米草[4]、蘆葦[5], 農(nóng)作物如茄子[6], 陸生植物如連翹、朱蕉[7]等, 關于沉水植物耐鹽堿的研究少之又少。鹽堿化過程對沉水植物的生長發(fā)育及其生態(tài)功能造成的影響是否與挺水植物相似, 還有待進一步研究。一般來說, 鹽脅迫會產(chǎn)生滲透效應和特殊離子效應, 以滲透效應為主; 而堿脅迫除這兩種效應外, 還有一個重要因素, 即高pH對植物生長的影響[8]。鹽化與堿化分別以鹽度和pH升高為主要特點, 這兩種作用的疊加往往產(chǎn)生1+1＞2的協(xié)同作用[9]。部分學者根據(jù)對植物的危害程度從大到小依次排序, 分別是鹽堿脅迫、堿脅迫、鹽脅迫[10]。那么, 在鹽堿化并伴隨富營養(yǎng)化趨勢的湖泊中如何恢復沉水植物, 是亟需考慮和解決的問題。

因此, 本實驗選取常作為觸發(fā)淺水湖泊穩(wěn)態(tài)轉換的先鋒種之一[11,12]、同時較能耐受鹽脅迫[13]的沉水植物金魚藻為對象, 研究堿脅迫和混合鹽堿脅迫對金魚藻生理變化的影響, 擬為鹽堿化湖泊的沉水植被先鋒種篩選和植被修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用金魚藻取自武漢東湖, 在實驗室中先用自來水浸泡沖洗3次, 再用去離子水沖洗3遍去掉雜質, 接著挑選出生長狀態(tài)較好的植株并去除殘枝后放置營養(yǎng)液中馴化培養(yǎng)3周, 期間定期換水并移出死亡植株殘體。營養(yǎng)液參考Hoagland’s配方并結合白鶴湖水體營養(yǎng)鹽成分后進行改良, 以保證植物所需基本元素同時模擬白鶴湖水質(配方見表1)。從培養(yǎng)好的金魚藻中挑選根莖葉完好、葉色正常的植株用于實驗, 馴化培養(yǎng)階段不計入實驗周期。

表1 金魚藻水培營養(yǎng)液配方Tab. 1 Nutrient solution formula for hydroponic culture of C.demersum

1.2 實驗設計

根據(jù)前期對白鶴湖水體的調查, 其全鹽量在0.2—1.5 g/L; 堿度主要由和少量提供,范圍在1—17 mmol/L; 混合鹽堿成分以NaCl、NaHCO3、Na2CO3三種鹽為主, 平均比例為NaCl ：NaHCO3： Na2CO3=10 ： 9 ： 1。

鹽度(g/L)=NaCl(g/L)+NaHCO3(g/L)+Na2CO3(g/L)。

為區(qū)分單一堿度以及混合鹽堿對金魚藻生長的影響, 同時為模擬實際水體水質條件, 實驗分為堿度梯度試驗和混合鹽堿脅迫實驗兩階段。

第一、堿度梯度實驗。實驗裝置為2 L燒杯12個, 將相同生物量的金魚藻引種至配好培養(yǎng)液的裝置中, 每個裝置中金魚藻質量濃度控制在10 g/L;設置A、B、C、D 四個梯度(表2), 每組3個平行。水質TN： 2.2—2.4 mg/L; TP： 0.11—0.18 mg/L。實驗持續(xù)14d, 每3—4天取一次植物樣; 研究單一堿度對植物生理的影響。

表2 兩階段實驗的堿、混合鹽堿成分Tab. 2 Composition of alkali and mixed salt and alkali in twostage experiments

第二、混合鹽堿脅迫實驗。實驗裝置為15 cm×20 cm×30 cm玻璃缸15個, 每個裝置中金魚藻質量濃度同樣控制在10 g/L; 設置a、b、c、d、e 五個梯度(表2), 每組3個平行。水質TN： 4.9—5.1 mg/L;TP： 0.13—0.19 mg/L。實驗周期35d, 每7天取一次植物樣用于各生理指標的測定。

兩階段實驗均在25℃恒溫室內(nèi)進行, 控制白天光強3000 lx、晚上光強200 lx, 光暗時間比12h ：12h。實驗過程中及時補充裝置水分; 觀察植物生長狀態(tài), 取金魚藻頂枝測定生理指標, 取樣時間為當天上午9：00—11：00; 于實驗開始和結束時測定水質指標, 監(jiān)測水質在線指標。

1.3 參數(shù)測定

植物主要生理生化指標測定方法參考《植物生理生化實驗原理和技術》[14,15]。其中過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法, 超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑法, 脯氨酸(Pro)采用酸性茚三酮比色法, 丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法, 葉綠素采用乙醇提取分光光度法。

水質理化參數(shù)總鹽度、pH等采用YSI水質在線監(jiān)測儀測定, 總堿度采用德國默克堿度測試盒測定, 水質指標總氮(TN)、總磷(TP)、化學需氧量(COD)的測定參見《水和廢水監(jiān)測分析方法》[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析, 用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析組別之間的差異顯著性,P＜0.01時認為有極顯著差異,P＜0.05時認為有顯著差異。用相關性分析(Pearson)檢驗鹽堿與各指標之間有無相關性及相關性強弱, 相關系數(shù)絕對值越接近于1, 則相關性越強。

2 結果

2.1 堿度梯度實驗中金魚藻的生長和生理變化

在堿度梯度實驗中, 各組別金魚藻在形態(tài)上均生長良好, 沒有表現(xiàn)出明顯的脅迫癥狀; 部分生理指標上的小幅變化, 在一定程度上顯示受到了堿度的影響, 其含量變化趨勢如圖1所示。

POD在實驗開始時顯示出隨堿度升高而活性降低的趨勢, 實驗后期各處理組的POD活性都有明顯降低, 且各組水平相近。

SOD能夠催化植物細胞內(nèi)的超氧化物發(fā)生歧化反應, 產(chǎn)生氧氣和過氧化氫。馬劍敏等[17]認為SOD變化趨勢應與POD變化總趨勢相同, 隨脅迫濃度增加而增加。而在本實驗中SOD的增長率隨堿度增加而下降, 沒有表現(xiàn)出堿度濃度越大而增長趨勢越明顯的現(xiàn)象。

膜脂過氧化產(chǎn)物MDA初始水平相近, 在第10天時有明顯的積累。MDA積累的越多時, 標準差也相應增大, 由于植物本身植株之間MDA積累能力的不同, 隨時間增長, 差異被放大。

滲透調節(jié)物質脯氨酸隨時間增長而逐漸降低,在實驗初期, 堿度越大脯氨酸含量越高。盡管實驗結束后脯氨酸都達到相似水平, 而脯氨酸的積累速度在一定程度上與NaHCO3濃度表現(xiàn)出相關性, 李源等[18]研究認為脯氨酸積累的快慢能體現(xiàn)植物對脅迫反應的敏感程度, 表明金魚藻對不同堿度的敏感程度不同。

在對水體堿度的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn), 未添加NaHCO3的對照組和低濃度處理組的堿度在實驗后期都有升高, 在實驗后期金魚藻的生理指標中也沒有顯示出梯度變化, 極有可能是空氣中CO2的溶解造成的。在后續(xù)的研究中可采取矯正措施或升高堿度濃度至空氣溶解作用可忽略不計。

2.2 混合鹽堿條件下的金魚藻生長和生理變化

在混合鹽堿脅迫下, 金魚藻的生長狀態(tài)出現(xiàn)較為明顯的差別。實驗進行的第7天已有脅迫現(xiàn)象(圖2), 不同組別金魚藻分別表現(xiàn)為： 對照組植物莖葉長勢一般; b處理組(0.6 g/L、3.8 mmol/L)的金魚藻在所有組別中長勢最好, 植物整體偏綠, 沒有表現(xiàn)出脅迫癥狀, 推測一定的鹽度能促進其生長; c處理組(1 g/L、6.3 mmol/L)處理組表現(xiàn)出輕微的脅迫癥狀, 較少的葉片發(fā)黃, 植物整體長勢不如b處理組;d處理組(2 g/L、12.6 mmol/L)表現(xiàn)出較為明顯的脅迫癥狀, 部分植株發(fā)黃枯萎, 葉片脫落, 整體長勢不如c處理組; e處理組(4 g/L、25.2 mmol/L), 所有植物都表現(xiàn)出較為嚴重的脅迫癥狀, 大面積發(fā)黃發(fā)黑,表現(xiàn)出衰敗的趨勢。在實驗第21天, 2 g/L處理組已有部分脫落在缸底的金魚藻葉片, 生物量減少約1/3, 存活下來的金魚藻都表現(xiàn)出較好的恢復趨勢;此時e處理組金魚藻已全部死亡(圖2)。

圖1 堿度對金魚藻POD、SOD、MDA、Pro的影響Fig. 1 Effects of alkalinity on POD, SOD, MDA and Pro of C. demersum

高濃度處理組脅迫特征明顯, 而對照組和低濃度處理組都沒有表現(xiàn)出較為明顯的脅迫癥狀。在混合鹽堿脅迫下金魚藻的生理指標變化見圖3, 對POD數(shù)據(jù)進行單因素方差分析, 結果顯示組別之間差異顯著(P＜0.05)。在第7天時, 各處理組POD活性已經(jīng)表現(xiàn)出差異, 在第14天后趨于相同, 差異減小。d處理組的金魚藻, 在第21天時POD達到最大,此時標準差也較大, 植株間的生長狀態(tài)發(fā)生了較大的差異, 金魚藻表現(xiàn)為有部分葉片變黃、脫落、枯萎死亡, 而部分存活。存活下來的金魚藻, POD逐漸降低, 在實驗第35天與低濃度處理組的POD含量趨于一致。而e處理組的金魚藻, POD活性一路升高, 表現(xiàn)出較為嚴重的脅迫癥狀, 第21天后全部死亡。金魚藻的POD活性變化與生長狀態(tài)變化趨勢完全一致。

在混合鹽堿脅迫下(圖3), 金魚藻SOD活性變化均有一個先升高再下降, 后趨于穩(wěn)定的變化趨勢,有明顯的脅迫特征。21d后SOD趨于穩(wěn)定, 金魚藻在生理形態(tài)上也基本恢復正常, 也說明了金魚藻已適應了鹽堿條件。從圖3中可以看出, 第7天時e處理組的SOD活性最高, 與POD活性變化趨勢一致。第二周開始各組SOD活性普遍下降, 只有e處理組金魚藻瀕臨死亡, SOD異常升高, 表明4 g/L鹽堿已經(jīng)超出了金魚藻耐鹽界限。

圖2 不同鹽堿條件下金魚藻生長趨勢Fig. 2 The growth trend of C. demersum under different saline and alkaline conditions

圖3 混合鹽堿對金魚藻POD、SOD、MDA、Pro的影響Fig. 3 Effects of salinity on POD, SOD, MDA and Pro of C. demersum

MDA含量隨脅迫時間增長有一定的積累, 2周后趨于平穩(wěn), 統(tǒng)計檢驗分析表明組別之間無明顯差異(P＞0.05)。脯氨酸含量e處理組明顯較其他組別高, 其余組別脯氨酸含量差異不大, 統(tǒng)計檢驗分析結果表明, 組別之間無明顯差異(P＞0.05)。趙勇[19]研究認為, 脯氨酸含量不能作為植物的耐鹽性指標,而可能是一種迫害指標, 表明e處理組的金魚藻受到鹽堿的迫害較嚴重。

在鹽脅迫條件下, 葉綠體是最敏感的細胞器之一。鹽脅迫破壞葉綠體結構, 使葉綠素含量下降,引起植株光合能力減弱[20]。葉綠素含量不僅直接關系著植物光合同化作用, 也是衡量植物耐鹽性的重要生理指標之一[21]。如圖4所示, 金魚藻葉綠素含量有先減后增的趨勢, 可體現(xiàn)出鹽堿對金魚藻的脅迫使葉綠素含量降低, 但1周后便能逐漸恢復。葉綠素的統(tǒng)計檢驗分析結果表明, 組別之間無明顯差異(P＞0.05)。

圖4 混合鹽堿對金魚藻葉綠素的影響Fig. 4 The effect of mixed salinity on chlorophyll of C. demersum

由表3可知, 在不同鹽堿脅迫下金魚藻對水中氮磷吸收不同, 去除率有隨鹽堿濃度升高而降低的趨勢。程憲偉[22]提出, 當鹽度過高時, 植物的生長將受到抑制、根際微生物的活動受到較大影響, 從而影響了植物對氮的吸收。e處理組混合鹽堿濃度過高, 氮去除率最低, 且總磷有不減反增的現(xiàn)象, 與植株大量死亡有關; COD在實驗開始時未添加, 在實驗結束后表現(xiàn)出鹽堿濃度越低COD越高的現(xiàn)象,COD含量與植物自身合成有機物的量有關, 這在一定程度上反映出鹽堿限制了植物自身的生長合成過程。

3 討論

鹽堿濃度越高, 金魚藻所受到的生長抑制越嚴重。王衛(wèi)紅等[23]研究結果表明, 金魚藻可耐受7.6 g/L以下的鹽度, 遠遠高出本實驗結果, 主要差異在于鹽堿的成分以NaCl為主。可以看出, 在同一水平下混合鹽堿對金魚藻的疊加傷害要遠遠大于單一鹽或堿脅迫。

3.1 抗氧化酶系統(tǒng)分析

植物在逆境脅迫下會產(chǎn)生活性氧, 損傷細胞蛋白質結構及功能, POD、CAT、SOD等抗氧化酶在逆境條件下會升高, 清除植物細胞內(nèi)的活性氧, 保護膜結構, 是植物重要的抗逆防御系統(tǒng)[24]。相對于生長指標, 抗氧化酶系統(tǒng)對外界脅迫的表征更迅速敏感, 其響應隨脅迫等級及物種的不同而不同; 由于其指標的可重復性不強, 所以一般通過對脅迫等級的響應規(guī)律來辨別沉水植物的抗脅迫本質[25]。

在堿度條件下金魚藻的抗氧化酶應對策略以POD為主, 而對無機氮升高的響應中以CAT為主[26]。劉燕等[27]對狐尾藻、黑藻、金魚藻三種沉水植物的研究發(fā)現(xiàn), 富營養(yǎng)條件下植物POD活性變化幅度大, MDA在脅迫后期升高, 與本研究中鹽堿條件下金魚藻的生理響應趨勢一致。

表3 不同鹽堿脅迫下水質指標去除率Tab. 3 The removal rate of water quality index under different salinities and alkali stress (%)

在混合鹽堿脅迫下, c組(堿度： 6.3 mmol/L, 鹽度1 g/L)鹽堿條件下的POD活性值較D組(堿度：17 mmol/L, 鹽度： 1.472 g/L)高出近10倍, 更加說明了混合鹽堿對金魚藻的生理脅迫傷害要遠遠大于單一堿度。稍高濃度處理組(b組)的金魚藻比低濃度處理組(a組)長勢更好, 而更高濃度處理組(c、d、e組)則表現(xiàn)出脅迫癥狀, 植物對鹽度表現(xiàn)出低促高抑的效應[28], 低濃度的鹽堿可以為植物提供生長所需元素離子, 早有研究表明沉水植物可利用水體中的無機碳(、等), 因此低濃度的鹽堿對金魚藻的生長起到的促進作用要遠遠大于它的脅迫抑制作用, 而高濃度鹽堿的效果則反之。金魚藻的POD活性在堿度條件下并無升高, 其脯氨酸含量對堿度變化的響應更為明顯。

本實驗中在混合鹽堿下金魚藻SOD值大都在100 U/g以上, 最高達到400 U/g, 遠高于劉燕等[27]研究富營養(yǎng)脅迫下金魚藻SOD值(幾乎在100 U/g以下, 最高不超過300 U/g)?？梢? 混合鹽堿對金魚藻造成的直接傷害要遠大于富營養(yǎng)化。

3.2 膜脂過氧化程度變化

過高的鹽、堿脅迫都能影響植物細胞膜的結構和功能, 引起膜透性增大、膜結構破壞等, 通過測量MDA的含量可以反應質膜的破壞程度[29]。也有研究表明, 丙二醛積累越多表明組織的保護能力越弱[30]?？寡趸到y(tǒng)保護酶的調節(jié)能力有限, 當細胞膜的損壞超過防御系統(tǒng)能力時, 體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化物酶及過氧化氫酶活性不能維持較高水平, 膜脂過氧化加重, 進而導致丙二醛含量升高[31]。在本研究中金魚藻MDA含量在實驗前后都有明顯積累, 但隨鹽堿的變化反而有降低趨勢,因此可得出鹽堿越高的實驗組中金魚藻的保護酶水平較高, 保護機制調動更明顯。

3.3 滲透調節(jié)物質變化

植物在抗鹽堿過程中, 除了吸收外界離子來調節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓之外, 還會自身合成有機物質脯氨酸等來調節(jié)滲透壓, 脯氨酸含量可作為植物對鹽脅迫的敏感性指標[32]。植物耐鹽性與脯氨酸含量的關系一直存在著爭議, 是由于滲透調節(jié)物質除脯氨酸外還有其他有機酸、可溶性糖等。不同植物的耐鹽機理不一樣, 不可單用脯氨酸的含量變化來對比評估植物的耐鹽性。在本實驗中脯氨酸含量對堿、鹽堿的響應較大, 與抗氧化酶系統(tǒng)的關系較符合協(xié)同調控作用。

3.4 光合能力變化

王旭明等[33]研究表明, 光合速率與丙二醛及脯氨酸都有相關性, 而葉綠素是植物光合能力的重要條件。在本實驗結果中, 發(fā)現(xiàn)葉綠素與丙二醛及脯氨酸都沒有明顯相關性(P＞0.05), 說明鹽堿脅迫可能不會直接影響金魚藻的光合色素, 而間接影響光合作用過程使光合速率下降, 其脅迫機理有待進一步探索。肖雯等[34]研究認為, 葉綠素含量并不能直接反映植物的耐鹽性, 但能表示植物在鹽堿條件下光合能力強弱, 可與其他指標綜合分析, 作為植物耐鹽性判斷的參考指標。

竇艷艷等[35]研究發(fā)現(xiàn), 水中能大大減少和緩解苦草所受富營養(yǎng)脅迫作用。Kahara等[36]表明許多沉水植物具有利用水中和CO2的能力;張彥輝等[37]也研究證明, 金魚藻能利用作為光合無機碳源, 在1.5 mmol/L(鹽度0.915 g/L)外源濃度下能促進金魚藻的生長。根據(jù)實驗結果及前人研究所得, 可得出實驗中的NaHCO3對金魚藻的生長是促進作用。濃度低時促進生長作用占主導, 濃度過高時脅迫作用占主導, 脅迫與促進作用是彼此交互還是各有濃度范圍, 機理有待進一步研究。

3.5 鹽堿條件對金魚藻吸收水中氮磷的影響

張永亮等[38]研究表明, 鹽脅迫會影響植物吸收營養(yǎng)鹽的能力。本研究中混合鹽堿與各指標的相關性分析見表4, TN、TP去除率與鹽堿濃度呈現(xiàn)顯著負相關性。體現(xiàn)出鹽堿脅迫越高, 對金魚藻吸收利用水中N、P營養(yǎng)鹽的影響越大。

表4 各項指標與混合鹽堿相關性分析Tab. 4 Correlation analysis of each index and mixed salinity

4 結論

在本研究中, POD是金魚藻應對鹽堿脅迫的主要抗氧化防御酶, 當外界鹽堿條件升高時, POD最先做出響應且活性較高; 當堿度17 mmol/L、鹽度1.472 g/L以下時, 金魚藻主要積累脯氨酸來應對,是主要的滲透調節(jié)物質, 這些可作為評估金魚藻耐鹽堿的綜合指標。