水培實驗中不同粒徑納米TiO2對金魚藻種子發(fā)芽和植株生長和生理的影響

文雙喜，王毅力

1. 北京林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083 2. 貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550005

納米二氧化鈦(TiO2-NPs)是一種人工金屬氧化物納米材料，因具有優(yōu)異的吸收紫外線能力、高效的光催化效果、良好的抗光化學(xué)腐蝕能力及導(dǎo)電能力，而被大量應(yīng)用在醫(yī)療、食品、化妝品、廢水處理、能量儲存、油漆及建筑材料等關(guān)系到國計民生的各行各業(yè)中[1-4]，預(yù)計其全球年產(chǎn)量在2025年將達(dá)到2.5×106t[5]。據(jù)澳大利亞政府官方報告顯示，在澳大利亞注冊的含TiO2-NPs的防曬化妝品已經(jīng)高達(dá)300多種[6]，甚至人類在工作場所呼吸的空氣中都會有納米顆粒的存在[7]。

納米材料在生產(chǎn)、消費和處置過程中不可避免地會通過污水廠尾水和工業(yè)廢水排放、大氣沉降、地表/地下徑流等方式進(jìn)入水體，影響水生生態(tài)系統(tǒng)[8]。近期研究表明，TiO2-NPs已經(jīng)在城市污水處理廠的出水、污泥以及地表水體中均有檢出。付佳露等[9]研究發(fā)現(xiàn)，長江口外取水點水樣中的納米顆粒形態(tài)的鈦濃度達(dá)89.0 μg·L-1；劉志遠(yuǎn)等[10]報道，曲陽污水處理廠水體中的鈦濃度達(dá)到768 μg·L-1；Kiser等[11]研究發(fā)現(xiàn)亞利桑那州生活污水廠中鈦濃度在0.1～3.0 mg·L-1的范圍內(nèi)波動。

自然水體是經(jīng)多種途徑釋放到環(huán)境介質(zhì)中的納米顆粒的最終受納體，因此進(jìn)入到天然濕地和人工濕地中的TiO2-NPs會在濕地生物、基質(zhì)、水體之間進(jìn)行遷移轉(zhuǎn)化和歸趨。已有的研究表明，植物是納米材料進(jìn)入環(huán)境及其在食物鏈中的向上傳遞和生物富集的重要通道之一[12]。因此，研究納米材料對濕地植物的影響特征可以揭示該材料在環(huán)境中的歸趨、生態(tài)毒理效應(yīng)及其去除機制。金魚藻是濕地中常見的植物，目前關(guān)于納米材料對金魚藻污染生態(tài)效應(yīng)方面的文獻(xiàn)還比較缺乏。因此，本研究選取金魚藻作為研究對象，考察不同粒徑TiO2-NPs對金魚藻種子發(fā)芽、植株生長形態(tài)和生理特征的影響，同時研究金魚藻植株對不同粒徑TiO2-NPs的吸收、累積及TiO2-NPs進(jìn)入植株后的分布特征。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗所用金魚藻種子購自南京景香園有限公司，所用金魚藻植株(展葉期，采于當(dāng)年5月)采自圓明園九州景區(qū)池塘。SOD試劑盒購于南京建成生物工程研究所，培養(yǎng)植物所用1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液按照文獻(xiàn)[13]中的方法配制。

4 nm、20 nm、50 nm的TiO2-NPs購于北京安特普納科貿(mào)責(zé)任有限公司(含量：≥99.5%；銳鈦礦∶金紅石=71∶29)，本研究中對3種粒徑TiO2-NPs的TEM圖像、各粒徑不同濃度TiO2-NPs在25 ℃、pH=6.5±0.1的1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位值及XRD圖譜(20 nm)進(jìn)行了表征或觀察。

主要儀器：帶能譜儀的透射電鏡(TEM-EDX, JEM-2100, JEOL, 日本)；Reichert超薄切片機(Ultracut，米力光國際貿(mào)易有限公司，英國)；X射線衍射儀(XRD, BruckerD-8 Diffractometer, 德國)；Zeta電位分析儀(Zetasizer 2000, Malvern, 英國)；光照培養(yǎng)箱(MGC-300B, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPS-1000IV, Shimadzu, 日本)；氣浴恒溫振蕩器(RH-8811，常州潤華電器有限公司)；7230型分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；立式高速冷凍離心機(GL-25MS, 匡貝實業(yè)有限公司)。

1.2 種子發(fā)芽試驗

為了保證發(fā)芽試驗的準(zhǔn)確性，挑選形態(tài)豐滿、品相良好的金魚藻種子(百粒重0.0334 g)進(jìn)行發(fā)芽試驗，考察不同濃度的TiO2-NPs對金魚藻種子的發(fā)芽影響。

種子和實驗器材消毒滅菌，TiO2-NPs處理濃度分別為0、20、100、200、500、1 000、2 000 mg·L-1，按文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行種子暴露處理，按文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行發(fā)芽試驗，每天(共6 d)記錄種子發(fā)芽數(shù)，發(fā)芽結(jié)束測定種子發(fā)芽重量，所有發(fā)芽試驗均設(shè)置3次重復(fù)。按照文獻(xiàn)[16]中的公式計算金魚藻種子的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢及活力指數(shù)等發(fā)芽指標(biāo)。

1.3 植株暴露培養(yǎng)

為了保證試驗結(jié)果的可靠性，所有金魚藻植株從圓明園取回后都先放入裝有1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液的50 cm×40 cm×35 cm玻璃水族箱中25 ℃下馴化培養(yǎng)15 d。

取馴化后生長情況相當(dāng)?shù)慕痿~藻植株放入裝有含不同濃度TiO2-NPs的1/4濃度霍格蘭氏植物培養(yǎng)液的1 000 mL燒杯中進(jìn)行TiO2-NPs暴露培養(yǎng)。把裝有植株的燒杯放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：白天/黑夜溫度(26/22±1) ℃；光照/黑暗周期16 h/8 h；光照強度300 μE·m-2·s-1，培養(yǎng)時間為10 d。

TiO2-NPs的濃度梯度設(shè)置為0、1、10、100、200和500 mg·L-1，每個燒杯放入約10 g金魚藻植株，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)，每天記錄植株生長情況。

1.4 植株生長指標(biāo)的測定

每2天取1.3中經(jīng)不同濃度TiO2-NPs溶液培養(yǎng)的金魚藻樣品進(jìn)行丙二醛(MDA)、葉綠素含量測定。培養(yǎng)結(jié)束取樣進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，SOD活性和MDA含量取根進(jìn)行測定。

其中，SOD酶活性按南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒的說明書進(jìn)行測定；MDA和葉綠素含量分別按照文獻(xiàn)[17]和[18]中的方法進(jìn)行測定。

1.5 TiO2-NPs在植株體內(nèi)的分布與累積

培養(yǎng)結(jié)束，取1.3中經(jīng)不同濃度TiO2-NPs溶液培養(yǎng)的金魚藻植株按文獻(xiàn)[19]中的方法進(jìn)行TEM-EDX觀察。另取適量樣品按文獻(xiàn)[20]中的方法利用ICP-MS測定樣品中的Ti含量。同時，由于鎂(Mg)是植物正常生長所必需的微量元素之一，是構(gòu)成葉綠素的中心分子，有促進(jìn)植物光合碳同化的作用，考慮到Mg含量和葉綠素之間的關(guān)系，在測定Ti含量的同時也測定樣品中Mg的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本試驗所有處理均設(shè)3次重復(fù)，以3個平行組數(shù)據(jù)計算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，采用ANOVA(Analysis of variance, LSD檢驗法)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05)，采用origin8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 TiO2-NPs表征結(jié)果

3種粒徑TiO2-NPs的TEM圖像、不同濃度TiO2-NPs在25 ℃、pH=6.5±0.1的1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位值及XRD圖譜(20 nm)如圖1所示。

圖1a～c中的TEM圖像顯示各粒徑的TiO2-NPs均呈圓形、橢圓形或長方形顆粒，平均粒徑與商家所標(biāo)基本吻合；TiO2-NPs(20 nm)的XRD圖譜如圖1d所示，在25.24°、37.7°、48.0°、55.04°、62.76°、70.22°和75.06°檢測到了峰的存在，其中25.24°到48.0°之間的峰為區(qū)分特征峰，與粉體衍射標(biāo)準(zhǔn)卡聯(lián)合委員會(JCPDS)數(shù)據(jù)庫No.21-1272號卡片吻合，表明本試驗所用TiO2-NPs的主要成分為銳鈦礦，滿足試驗需求。從圖1e中可以看出：各粒徑不同濃度的TiO2-NPs在1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位整體數(shù)值范圍在±10.0～±30.0之間，說明分散體系不太穩(wěn)定[21]，因此，在培養(yǎng)實驗中需要每天定時對培養(yǎng)液進(jìn)行攪動數(shù)次，保證TiO2-NPs顆粒在溶液中保持良好的分散狀態(tài)。

2.2 TiO2-NPs對金魚藻種子發(fā)芽的影響

不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs溶液處理后的金魚藻種子發(fā)芽率及發(fā)芽重量見圖2，主要發(fā)芽指數(shù)如表1所示。

從圖2a中可以看到，3種粒徑的TiO2-NPs處理均對金魚藻種子的發(fā)芽有一定的抑制作用，且TiO2-NPs粒徑越小、濃度越高抑制作用越明顯。4 nm、20 nm和50 nm的TiO2-NPs對金魚藻種子發(fā)芽的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為1 180、1 520和1 810 mg·L-1，當(dāng)濃度為2 000 mg·L-1時，3種粒徑TiO2-NPs處理后金魚藻種子的發(fā)芽率分別由空白處理的88.33%下降到27.67%(4 nm)、31.67%(20 nm)和39.67%(50 nm)。

圖1 TiO2-NPs的TEM表征(a-4 nm；b-20 nm；c-50 nm)以及XRD圖譜(d-20 nm)和25 ℃下不同濃度的TiO2-NPs在1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位Fig. 1 TEM images (a-4 nm; b-20 nm; c-50 nm) and physical properties of TiO2-NPs (d-20 nm) XRD patterns; (e) zeta potential vs. different TiO2-NPs concentrations in 25% strength Hoagland nutrient solution at 25 ℃

表1 TiO2-NPs處理對金魚藻種子發(fā)芽的影響Table 1 The effects on the germination of Ceratophyllum demersum seeds treated with TiO2-NPs

圖2 TiO2-NPs處理后金魚藻種子的發(fā)芽率(a)和發(fā)芽重量(b)注：*代表不同處理與空白對照之間存在顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Germination rates (a) and seedling masses (b) of Ceratophyllum demersum seeds under TiO2-NPs treatmentNote: * indicates a significant difference between the treatment and the control groups (P<0.05).

圖3 不同粒徑的TiO2-NPs處理下金魚藻植株的生長形態(tài)Fig. 3 Ceratophyllum demersum cultured under different TiO2-NPs sizes

從圖2b中可以看出，TiO2-NPs處理后金魚藻種子發(fā)芽幼苗重量的變化趨勢基本與發(fā)芽率的變化趨勢一致，當(dāng)TiO2-NPs濃度為2 000 mg·L-1時，3種粒徑TiO2-NPs處理的金魚藻種子的發(fā)芽幼苗重量由空白處理的0.218 g分別下降到0.051 g(4 nm)、0.077 g(20 nm)和0.107 g(50 nm)。可能是因為高濃度的TiO2-NPs處理后進(jìn)入金魚藻種子的TiO2-NPs量增加，對金魚藻種子的生理機能造成損傷，并且隨著顆粒尺度變小，TiO2-NPs表面晶格破損程度更高，產(chǎn)生活性位點更多，形成超氧自由基及其他活性氧化物質(zhì)(ROS)更多，氧化壓力(OS)提高，導(dǎo)致種子內(nèi)脂質(zhì)過氧化，破壞種子細(xì)胞膜，因此對金魚藻種子發(fā)芽產(chǎn)生更明顯的抑制作用[22]。

由表1可以看出，各粒徑TiO2-NPs處理后金魚藻種子的各項發(fā)芽指標(biāo)均有不同程度的下降，且TiO2-NPs粒徑越小、濃度越高降低幅度越大，說明粒徑越小、濃度越高，TiO2-NPs對金魚藻種子發(fā)芽的抑制作用越強。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是粒徑小的TiO2-NPs更加容易穿透金魚藻種子的種皮進(jìn)入到種子體內(nèi)，從而對種子的發(fā)芽產(chǎn)生影響。常見的生物大分子和活性物質(zhì)其粒徑基本都處于納米級，細(xì)胞當(dāng)中的細(xì)胞膜上的孔徑、核膜上的孔徑和離子通道等通常也在納米級別[23]，當(dāng)納米材料的粒徑小到一定的程度時，納米顆粒就可以直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而對細(xì)胞正常的新陳代謝產(chǎn)生影響。

2.3 TiO2-NPs對金魚藻植株生長與生理的影響

2.3.1 植株生長形態(tài)

不同粒徑的TiO2-NPs處理下金魚藻植株的生長形態(tài)如圖3所示。從圖中可以看出，經(jīng)過10 d的培養(yǎng)后，空白對照(0 mg·L-1)處理的金魚藻植株整體生長狀況良好，顏色呈青綠色；各粒徑TiO2-NPs處理隨著濃度的升高金魚藻的生長均受到不同程度的抑制，表現(xiàn)為葉片失綠發(fā)黃、脫落，植株呈萎焉狀，且TiO2-NPs的粒徑越小，上述影響越明顯。已有研究表明TiO2-NPs可以通過植物根部進(jìn)入細(xì)胞，通過物理阻塞作用使植物細(xì)胞細(xì)胞壁孔徑變小，從而影響植物細(xì)胞的正常生理功能，致使植物生長受到抑制[24]。

圖4 不同濃度TiO2-NPs處理后金魚藻植株葉綠素含量(a-4 nm; b-20 nm; c-50 nm)和Mg(d)含量的影響Fig. 4 Chlorophyll (a-4 nm; b-20 nm; c-50 nm) and Mg (d) content of Ceratophyllum demersum cultured under different TiO2-NPs concentrations

2.3.2 葉綠素與Mg含量

不同粒徑、不同濃度的TiO2-NPs處理對金魚藻植株葉綠素含量的影響結(jié)果如圖4所示。培養(yǎng)10 d后，空白處理(0 mg·L-1)下的金魚藻葉片的總?cè)~綠素含量在10 d的培養(yǎng)期間基本穩(wěn)定在同一濃度水平；而不同粒徑TiO2-NPs處理下金魚藻葉綠素含量均隨處理濃度的升高而下降，且粒徑越小下降幅度越大。在經(jīng)過濃度為500 mg·L-1的不同粒徑的TiO2-NPs暴露培養(yǎng)10 d后，金魚藻葉片的總?cè)~綠素含量從剛移栽的3.43 mg·g-1分別下降到1.01(4 nm)、1.16(20 nm)和1.86 mg·g-1(50 nm)。

從圖4d中可以看出，隨著暴露培養(yǎng)時間的延長和TiO2-NPs處理濃度的升高金魚藻植株體內(nèi)不同組織部位的Mg含量均出現(xiàn)不同程度的減少，整體變化趨勢與葉片總?cè)~綠素含量的變化趨勢相仿。說明TiO2-NPs處理影響了金魚藻植株對Mg的吸收，進(jìn)而影響到植株葉綠素的合成。

2.3.3 SOD活性和MDA含量

各種酶活性的調(diào)節(jié)是植物自我保護(hù)的體現(xiàn)，SOD則是生物體內(nèi)清除自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷的首要物質(zhì)，它可阻止氧自由基對細(xì)胞造成的損害并修復(fù)受損細(xì)胞[25]。不同粒徑、不同濃度的TiO2-NPs處理對金魚藻植株SOD酶活性和MDA含量的影響結(jié)果如圖5所示。從圖5a中可知，當(dāng)TiO2-NPs濃度低于100 mg·L-1時，各粒徑TiO2-NPs處理后金魚藻體內(nèi)的SOD活性隨TiO2-NPs濃度的升高不斷增強，且TiO2-NPs的粒徑越小金魚藻植株體內(nèi)的SOD活性越高，可能是因為TiO2-NPs更容易進(jìn)入金魚藻體內(nèi)，從而對金魚藻植株產(chǎn)生更強的毒害作用，致使對金魚藻的氧化脅迫水平升高，表明3種粒徑TiO2-NPs對金魚藻都具有一定的毒害作用，金魚藻體內(nèi)SOD活性升高以清除納米脅迫產(chǎn)生的ROS。4 nm和20 nm TiO2-NPs處理在濃度為100 mg·L-1時金魚藻體內(nèi)SOD活性達(dá)到最大值，分別為39.57 U·g-1FW(4 nm)和37.37 U·g-1FW(20 nm)。當(dāng)TiO2-NPs濃度超過100 mg·L-1時，4 nm和20 nm TiO2-NPs處理的金魚藻體內(nèi)SOD活性隨濃度升高而下降，而50 nm TiO2-NPs處理的金魚藻體內(nèi)SOD活性則隨著濃度的升高繼續(xù)上升，并在濃度為500 mg·L-1時達(dá)到最大值32.96 U·g-1FW，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是4 nm和20 nm的TiO2-NPs由于粒徑更小，更加容易進(jìn)入金魚藻體內(nèi)，當(dāng)TiO2-NPs濃度超過100 mg·L-1時，由于大量的TiO2-NPs進(jìn)入金魚藻植株體內(nèi)，對金魚藻植株產(chǎn)生毒害作用，金魚藻植株體內(nèi)的抗氧化機制運作遭到抑制和破壞，因而SOD活性開始隨著濃度的升高而持續(xù)下降。

圖5 不同濃度處理對金魚藻體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)酶活性(a)和丙二醛(MDA)(b-4 nm; c-20 nm; d-50 nm)含量的影響Fig. 5 Superoxide dismutase (SOD) activity (a) and malondialdehyde (MDA) content (b-4 nm; c-20 nm; d-50 nm) of Ceratophyllum demersum

圖6 500 mg·L-1 TiO2-NPs處理金魚藻的TEM-EDX觀察(a-4 nm; b-20 nm; d-50 nm)以及EDX掃描表明Ti的存在(f)Fig. 6 TEM analysis of TiO2-NPs distribution in Ceratophyllum demersum exposed to 500 mg L-1 of TiO2-NPs (a-4 nm; b-20 nm; d-50 nm) and EDX analysis of the bright zone showing the presence of Ti (f)

圖5b～d表明了金魚藻體內(nèi)MDA含量與不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs暴露培養(yǎng)處理的關(guān)系，由圖中可以看到，空白處理下的金魚藻根系的MDA含量在整個培養(yǎng)期間(0～10 d)內(nèi)都保持在一個穩(wěn)定的水平，沒有出現(xiàn)大幅波動；但當(dāng)各粒徑TiO2-NPs濃度為1～500 mg·L-1時，金魚藻體內(nèi)的MDA水平隨著培養(yǎng)時間的推進(jìn)而不斷升高，隨著TiO2-NPs濃度的升高而快速上升，并且粒徑越小上升幅度越大。不同粒徑TiO2-NPs在濃度為500 mg·L-1時金魚藻體內(nèi)的MDA含量由移栽時的0.25 μmol·g-1分別上升到0.97(4 nm)、0.85(20 nm)和0.75 μmol·g-1(50 nm)，分別出現(xiàn)了高達(dá)388%、340%和300%的增長。這表明TiO2-NPs對金魚藻有一定的毒害作用，能迫使金魚藻植株體內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生大量MDA，且TiO2-NPs的粒徑越小對金魚藻的毒害作用越強。

2.4 TiO2-NPs顆粒在金魚藻植株體內(nèi)的分布

經(jīng)500 mg·L-1不同粒徑TiO2-NPs暴露培養(yǎng)10 d后，金魚藻植株切片的TEM-EDX分析結(jié)果如圖6所示。

從圖中可以看出，3種粒徑TiO2-NPs處理的金魚藻植株中都發(fā)現(xiàn)了顆粒沉積物的存在，且粒徑越小金魚藻根中的沉積物越多。這些顆粒沉積物很有可能是被金魚藻吸收轉(zhuǎn)運進(jìn)來的TiO2-NPs顆粒。為了確認(rèn)這些沉積顆粒的成分，利用能譜分析儀對顆粒物沉積區(qū)域進(jìn)行掃描，通過顆粒沉降物的EDX光電子能譜圖(圖6f)發(fā)現(xiàn)這些顆粒沉積物中含有很高含量的Ti元素，因此，這些沉積顆粒應(yīng)該就是被金魚藻吸收轉(zhuǎn)運進(jìn)入體內(nèi)的TiO2-NPs顆粒。

納米材料要進(jìn)入植物體內(nèi)必須通過植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，資料顯示一般植物的細(xì)胞壁上的孔徑尺寸大約為5～20 nm[26]，小于細(xì)胞壁孔徑的納米顆?？梢灾苯哟┻^細(xì)胞壁進(jìn)入植物細(xì)胞體內(nèi)，而大于細(xì)胞壁孔徑的納米顆粒則須通過內(nèi)吞和主動運輸?shù)确绞讲拍苓M(jìn)入植物體內(nèi)[27]，因而本研究中4 nm的TiO2-NPs處理后金魚藻體內(nèi)觀察到沉積顆粒物最多，20 nm的TiO2-NPs處理次之，50 nm的TiO2-NPs處理后金魚藻內(nèi)的顆粒沉積物最少。

2.5 Ti在金魚藻體內(nèi)的累積量

經(jīng)過ICP-MS檢測經(jīng)不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs暴露培養(yǎng)后金魚藻植株體內(nèi)的Ti元素累積量，結(jié)果如圖7所示。

圖7 ICP-MS測定Ti在金魚藻體內(nèi)的累積量Fig. 7 ICP-MS observations of Ti accumulation in Ceratophyllum demersum

從圖中可以看到，經(jīng)不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs培養(yǎng)處理后的金魚藻體內(nèi)的Ti含量隨著TiO2-NPs處理濃度的升高而不斷上升，且TiO2-NPs的粒徑越小上升幅度越大。3種粒徑的TiO2-NPs在處理濃度為500 mg·L-1時金魚藻體內(nèi)的Ti含量由空白處理時的1.47 μg·g-1分別上升到996 μg·g-1(4 nm)、866 μg·g-1(20 nm)和529 μg·g-1(50 nm)。巴翠蘭[20]研究發(fā)現(xiàn)20 nm的TiO2-NPs顆粒能進(jìn)入黃瓜的根系，Ti元素在黃瓜根系內(nèi)的累積量為960 μg·g-1左右。本研究證明4 nm、20 nm和50 nm的TiO2-NPs顆粒均能進(jìn)入金魚藻植株體內(nèi)，但是粒徑越大進(jìn)入金魚藻體內(nèi)的難度越大，金魚藻體內(nèi)的Ti含量越低。