對(duì)羥基苯甲酸對(duì)尖孢鐮刀菌生物學(xué)特性及侵染毒力的影響

趙靜 常繼東 鄭麗君 王志遠(yuǎn)

摘要：明確對(duì)羥基苯甲酸對(duì)尖孢鐮刀菌侵染毒力的影響，可為克服三七連作障礙提供有效的策略。結(jié)合熒光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）染色及馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板萌發(fā)法，分析不同濃度下對(duì)羥基苯甲酸與尖孢鐮刀菌孢子活性的相關(guān)性;采用酶學(xué)法分析不同濃度下對(duì)羥基苯甲酸對(duì)真菌纖維素酶分泌的影響。FDA-PI染色結(jié)果表明，當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)，尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最多，孢子活性最強(qiáng)。PDA平板萌發(fā)測定結(jié)果顯示，對(duì)羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時(shí)，尖孢鐮刀菌孢子的平均萌發(fā)率為58.05%，孢子萌發(fā)率最高。低濃度的對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加，而高濃度下降低;對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)，纖維素酶活性最高，峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)4d時(shí)，達(dá)到1.57U/mL，是相同時(shí)間下對(duì)照的5.6倍。研究表明，低濃度對(duì)羥基苯甲酸（1～5mmol/L）脅迫有利于尖孢鐮刀菌孢子生長，且提高其分泌的纖維素酶活性。

關(guān)鍵詞：對(duì)羥基苯甲酸;尖孢鐮刀菌;孢子活性;纖維素酶

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0291-04

作者簡介：趙靜（1983—），女，云南玉溪人，博士，副教授，主要從事作物病蟲害與防治研究。E-mail：hujun_maolv@163.com。

通信作者：王志遠(yuǎn)，博士，副教授，主要從事作物病蟲害與防治研究。E-mail：yuan33441@sina.com。

三七根腐病是三七生產(chǎn)中的一類重要病害，不僅影響三七產(chǎn)量，更影響三七質(zhì)量，其中以鐮刀菌型根腐病最為多見[1]。在三七栽培中，隨著連作年限的延長根腐病發(fā)病率明顯增加[2]。根腐病的發(fā)生與連作條件下植物根系分泌物對(duì)病原菌的化感作用有密切關(guān)系。研究三七根系分泌物對(duì)病菌的化感致病性是解析連作條件下根腐病形成機(jī)制的有效途徑。

在植物的生長發(fā)育過程中，根系作為植物與土壤的接觸部分，不僅從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，還通過分泌的方式向周圍釋放一些無機(jī)離子和有機(jī)化合物，這些物質(zhì)是一類復(fù)雜的混合物，是植物連作對(duì)根際土壤微生物產(chǎn)生影響的重要媒介之一，參與植物與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換與信號(hào)傳遞，是根際最為重要的營養(yǎng)和能量來源，也是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素[3-5]。對(duì)羥基苯甲酸為酚酸類化感物質(zhì)，是自然界中常見的化合物，存在于高等植物、微生物、苔蘚和土壤中。酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致作物產(chǎn)生連作障礙的主要因素，它可以直接或間接地促進(jìn)或抑制微生物生長，進(jìn)而影響作物生長。Ren等研究了叢枝菌根定殖是否能緩解西瓜枯萎病，改變植物對(duì)病原菌的反應(yīng)，結(jié)果表明，叢枝菌根的侵染抑制了西瓜根和根際病原菌的生長，使病害指數(shù)降低了89.3%，這是因?yàn)閰仓那秩靖淖兞烁捣置谖?，抑制了西瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)[6]。郝文雅等以不同抗性西瓜品種以及化感水稻品種為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其根系分泌物中可溶性糖和游離氨基酸的含量和組成進(jìn)行分析，并研究了氨基酸對(duì)西瓜?；图怄哏牭毒L的影響，結(jié)果表明，西瓜的根系分泌物能夠促進(jìn)鐮刀菌孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢，而水稻根系分泌物卻具有反向作用[7]。

本研究擬探究對(duì)羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性及致病毒力，以探明對(duì)羥基苯甲酸對(duì)尖孢鐮刀菌的化感作用，以期為連作條件下根腐病的發(fā)生及病害防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株及試驗(yàn)時(shí)間

尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。試驗(yàn)于2019年在玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2孢子活性的檢測

1.2.1孢子懸浮液的制備

將尖孢鐮刀菌菌株分別在含有1、5、10、50mmol/L對(duì)羥基苯甲酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中于26℃下振蕩培養(yǎng)7d，以不添加對(duì)羥基苯甲酸的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。將培養(yǎng)好的病原菌孢子混合液依次用200目（孔徑0.075mm）和300目（孔徑0.048mm）篩網(wǎng)過濾，去除菌絲和培養(yǎng)基雜質(zhì)。然后取30mL濾液于50mL離心管中，在5000r/min下離心5min，去上清液后以無菌水進(jìn)行重懸并離心，重復(fù)2～3次。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH值為7.4）將孢子重懸。

1.2.2FDA-PI熒光染液的配制、染色及孢子死亡率的計(jì)算

熒光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）熒光染液的配制及染色參照柴阿麗等的方法[8]，尖孢鐮刀菌孢子懸浮液染色后于熒光顯微鏡下觀察，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器根據(jù)孢子著色情況計(jì)算孢子死亡率。

1.3孢子萌發(fā)率的計(jì)算

制備對(duì)羥基苯甲酸濃度分別為1、5、10、50mmol/L的PDA培養(yǎng)基，以不添加對(duì)羥基苯甲酸的PCA培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。把滅過菌的微孔濾膜平鋪在制備好的PDA平板上，使微孔濾膜平鋪于培養(yǎng)基表面，把制備的孢子懸浮液平鋪在濾膜上，用三角玻璃棒將菌懸液涂布均勻（每個(gè)平板涂布70μL菌懸液），用封口膜封口后置于28℃下培養(yǎng)，5～8h后制作玻片觀察并記錄孢子的萌發(fā)情況，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)樣本檢查100個(gè)孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.4酶活性的測定

纖維素酶活性的測定采用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）法。

2結(jié)果與分析

2.1FDA-PI熒光染色效果觀察和孢子死亡率的計(jì)算

尖孢鐮刀菌新鮮孢子懸浮液利用FDA染液單染后，在熒光顯微鏡下，活孢子呈亮綠色熒光（圖1-a）;經(jīng)加熱致死的孢子利用PI染液單染后，死孢子發(fā)出紅色熒光（圖1-b）。取1mL新鮮孢子懸浮液與1mL[JP+1]加熱致死的孢子懸浮液混合均勻，經(jīng)FDA-PI染液染色后，在熒光顯微鏡下可明顯觀察到發(fā)出紅色熒光的死孢子和發(fā)出綠色熒光的活孢子（圖1-c）。上述結(jié)果表明，采用FDA-PI染色方法能較好地對(duì)尖孢鐮刀菌孢子的死活進(jìn)行判斷，其中活孢子呈綠色熒光，死亡孢子呈紅色熒光。

[JP3]由表1可知，在不同濃度（0、1、5、10、50mmol/L）對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量有較大區(qū)別。其中，對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)產(chǎn)孢數(shù)量最多，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測得出，孢子數(shù)量為180萬個(gè)/mL，其次為含1mmol/L對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢數(shù)量為170萬個(gè)/mL。對(duì)羥基苯甲酸濃度為50mmol/L時(shí)不產(chǎn)孢子。經(jīng)FDA-PI雙染后死孢子在熒光顯微鏡下呈紅色，活孢子呈綠色。在0、1、5、10mmol/L對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌孢子死亡率分別為79%、75%、64%、70%，懸浮液中孢子死亡個(gè)數(shù)分別為94.8萬、127.5萬、115.2萬、56.0萬個(gè)/mL。當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)，尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最多，經(jīng)FDA-PI染色后，孢子存活率也最高。

2.2對(duì)羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)率

采用PDA平板法觀察孢子的萌發(fā)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)羥基苯甲酸濃度為1、5mmol/L的培養(yǎng)基中，孢子萌發(fā)最早，萌發(fā)時(shí)間為5.5h。其次為對(duì)照，萌發(fā)時(shí)間為6h。對(duì)羥基苯甲酸濃度為10mmol/L時(shí)，萌發(fā)時(shí)間為11h，而羥基苯甲酸濃度為50mmol/L時(shí)，尖孢鐮刀菌孢子無萌發(fā)。

由圖2可知，不同濃度對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)率不同，其中CK組的平均萌發(fā)率為42.45%;對(duì)羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時(shí)，孢子萌發(fā)率最高，平均萌發(fā)率為58.05%;對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)，孢子的萌發(fā)率低于濃度為1mmol/L時(shí)，平均萌發(fā)率為50.8%，對(duì)孢子的萌發(fā)仍有促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用減緩;對(duì)羥基苯甲酸濃度為10mmol/L時(shí)，孢子萌發(fā)率低于空白對(duì)照組，平均萌發(fā)率為29.5%，對(duì)孢子的萌發(fā)開始有抑制作用;當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度50mmol/L時(shí)，完全抑制孢子的萌發(fā)，孢子平均萌發(fā)率為0。

2.3對(duì)羥基苯甲酸脅迫下纖維素酶活性的變化

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和壁蛋白等組成。其中，纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)[9]。植物細(xì)胞壁是植物健康的保障，病原菌可以通過入侵植物細(xì)胞壁，分泌細(xì)胞壁降解酶使植物受到侵染而感病[10]。因此，細(xì)胞壁降解酶是病原菌侵染寄主組織的主要致病因子之一[11]。由圖3可知，在低濃度的對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加，而高濃度下降低。對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)，纖維素酶活性最高，峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)4d時(shí)，達(dá)到1.57U/mL，是相同時(shí)間下對(duì)照的5.6倍。由此可以得知，低濃度對(duì)羥基苯甲酸有利于尖孢鐮刀菌入侵植物組織。

3討論

研究表明，酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致作物產(chǎn)生連作障礙的主要因素，它可以直接或間接地促進(jìn)或抑制微生物生長，進(jìn)而影響作物生長[12]。馬燕會(huì)等通過盆栽試驗(yàn)及高效液相色譜（HPLC）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸可增加根系分泌物中對(duì)鐮刀菌生長具有促進(jìn)作用的氨基酸種類和含量[13]。甄文超等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸可提高草莓根際鐮刀菌的數(shù)量，致使根際微生物組成由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變[14]。在前期研究中，筆者已明確從三七重茬土壤中提取到的29種化感物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯的化感作用[15]。本研究中，對(duì)羥基苯甲酸在低濃度下可增加孢子產(chǎn)孢活性，促進(jìn)孢子的萌發(fā)，最適宜的濃度為5mmol/L，該濃度下，尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最高，且通過FDA和PI雙熒光復(fù)染法檢測得出，孢子存活率最高，死亡率最低，另外在該濃度下尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性也最高。

熒光素二乙酸酯（fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA）可以自由通過細(xì)胞膜，被非特異性酯酶分解產(chǎn)生熒光素，并積蓄在活細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光[16]。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）不能透過完整的細(xì)胞膜，但能夠透過死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核被染紅[16]。本研究中，在對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，利用FDA-PI染色及PDA平板萌發(fā)法檢測孢子活性，發(fā)現(xiàn)在相同濃度對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，PDA平板萌發(fā)法測定的孢子活性更強(qiáng)。如當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)，PDA平板萌發(fā)法測得的孢子平均萌發(fā)率為50.8%;而通過FDA-PI染色法得出，活孢子比例為37%，遠(yuǎn)低于平板萌發(fā)法。這說明FDA-PI染色劑對(duì)孢子活性具有一定的抑制作用，但相較于PDA平板萌發(fā)法方便、快捷。

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