固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定鹵菜中的蒂巴因

陳偉，喬勇升，胡慧

泰州市食品藥品檢驗(yàn)所（泰州 225300）

蒂巴因是罌粟植物中的一種生物堿，有一定的藥用價(jià)值，也是一些藥物合成中的重要中間體，其中罌粟殼中就含有的這類生物堿[1]。蒂巴因不僅會(huì)導(dǎo)致人失眠或者嗜睡，引起心理上某種程度的愜意和愉悅感，還會(huì)導(dǎo)致人注意力、記憶和思維各方面身體性能的衰退，如果長(zhǎng)期食用還會(huì)引起精神紊亂，神經(jīng)失常，使神經(jīng)和消化系統(tǒng)受到損害，造成內(nèi)分泌失調(diào)最終成癮，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)氯酥舷⒑退劳鯷2-4]。我國(guó)對(duì)于罌粟殼的使用有明確的法律規(guī)定，嚴(yán)禁非法使用。有的不法商販利用罌粟殼能使人成癮，在食品中尤其是鹵菜、火鍋等食物的湯輔料中進(jìn)行罌粟殼及其水浸物的非法添加，使消費(fèi)者成癮，以此來吸引更多的顧客，從中牟取暴利，極大地危害人民群眾的身體健康。因此，能快速、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出鹵菜類食品中是否非法添加罌粟殼，是否含蒂巴因等生物堿含量，可以為執(zhí)法機(jī)構(gòu)提供有力的技術(shù)支持，具有很大的社會(huì)價(jià)值。

目前，蒂巴因的檢測(cè)研究方法并不多，參照相關(guān)文獻(xiàn)[5-9]中罌粟堿類物質(zhì)的檢測(cè)研究方法，并結(jié)合蒂巴因物質(zhì)本事的特點(diǎn)，選擇液相色譜法檢測(cè)，并結(jié)合熒光檢測(cè)器對(duì)含苯環(huán)類物質(zhì)特有的熒光反應(yīng)，應(yīng)用于鹵菜類食品中蒂巴因的檢測(cè)，并優(yōu)化檢測(cè)參數(shù)，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 2695）；二極管陣列檢測(cè)器（Waters 2625）；熒光檢測(cè)器（Waters 2475）。

蒂巴因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL，lot 228012，購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；甲醇、乙腈（色譜純）；HLB固相萃取柱（Waters公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；熒光檢測(cè)器，發(fā)射波長(zhǎng)477 nm，激發(fā)波長(zhǎng)333 nm；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)器的選擇對(duì)蒂巴因色譜行為的影響

蒂巴因的檢測(cè)一般都可以用二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器這兩種檢測(cè)器來檢測(cè)，試驗(yàn)對(duì)兩種檢測(cè)器分析比較，選擇較合適檢測(cè)蒂巴因的檢測(cè)器。

1.3.2 不同流動(dòng)相體系對(duì)蒂巴因色譜行為的影響

參考文獻(xiàn)[10-12]，蒂巴因?qū)儆跇O性化合物，因此流動(dòng)相以水和乙腈作為基礎(chǔ)溶劑。為了促進(jìn)樣品的離子化，試驗(yàn)比較了流動(dòng)相中加入三乙胺對(duì)蒂巴因分離效果的影響。分別考察不同濃度的三乙胺水溶液以及不同的流動(dòng)相比例對(duì)蒂巴因目標(biāo)峰分離度以及色譜基線的影響，確定最佳流動(dòng)相體系。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取相應(yīng)體積的蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μ g/mL），用乙腈分別配制成0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 提取溶劑的選擇、凈化方式的比較

參考文獻(xiàn)[13-16]，一般選用固液提取法進(jìn)行提取，并選擇HLB小柱進(jìn)行凈化富集。結(jié)合鹵菜類食品的樣品性質(zhì)，選擇體積分?jǐn)?shù)20%乙腈溶液進(jìn)行蒂巴因的提取，并分別比較不同料液比、洗脫液對(duì)目標(biāo)物測(cè)定值的影響。

1.3.5 樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)

以未檢出蒂巴因的鹵菜為空白基質(zhì)，加入蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用固相萃取提取后，上機(jī)檢測(cè)計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)器的選擇對(duì)蒂巴因色譜行為的影響

如圖1所示，二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器均采用外標(biāo)法定量，且目標(biāo)物在兩種檢測(cè)器中都有響應(yīng)。但是相比較二極管陣列檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器的靈敏度更高，基質(zhì)干擾更小，一般情況下熒光檢測(cè)器比二極管陣列檢測(cè)器的靈敏度高約兩個(gè)數(shù)量級(jí)，同樣濃度的蒂巴因溶液，在熒光檢測(cè)器中得到的目標(biāo)峰響應(yīng)值更高，穩(wěn)定性更好，所以試驗(yàn)選擇熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 流動(dòng)相體系對(duì)蒂巴因色譜行為的影響

流動(dòng)相中加入0.01%三乙胺后，流動(dòng)相體系有較好的穩(wěn)定性，能抑制蒂巴因色譜峰的拖尾現(xiàn)象，故確定采用乙腈-三乙胺體系。再比較三乙胺水溶液濃度對(duì)目標(biāo)物色譜行為的影響，分別以0.02%，0.01%和0.005%三乙胺水溶液為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，以0.005%三乙胺水溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，色譜峰基線發(fā)生漂移，以0.02%和0.01%三乙胺水溶液進(jìn)行洗脫時(shí)色譜峰都較好，為了保護(hù)色譜柱，故選擇乙腈-0.01%三乙胺水溶液為流動(dòng)相。對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了優(yōu)化考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）等度洗脫時(shí)，色譜峰基線穩(wěn)，峰形好，分離度均大于1.5，不對(duì)稱因子在0.95～1.05之間。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

為了驗(yàn)證蒂巴因在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了蒂巴因質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，蒂巴因在0.5～50.0 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99），具體見表1。

圖1 二極管陣列檢測(cè)器（a）和熒光檢測(cè)器（b）對(duì)蒂巴因色譜圖的影響

表1 蒂巴因的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.4 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇

稱取2.0 g樣品與20%乙腈提取液，分別按料液比1∶2，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）混合，超聲提取30 min后，在上述優(yōu)化好的儀器條件下測(cè)定，以加標(biāo)回收率為比較依據(jù)。

如圖2所示，當(dāng)料液比為1∶5和1∶10（g/mL）時(shí)，蒂巴因的測(cè)定回收率明顯高于1∶2，1∶15和1∶20（g/mL）時(shí)的含量。溶劑過少，兩相濃度梯度小，蒂巴因不能被完全溶出。隨著料液比的增大，兩相濃度梯度增大，蒂巴因逐漸被溶出，回收率不斷增加；當(dāng)料液比為1∶5（g/mL）時(shí)，蒂巴因的測(cè)定值最高，且誤差線較小。當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時(shí)，進(jìn)一步增加溶劑的量，可能會(huì)溶解更多樣品中的其他的物質(zhì)，妨礙蒂巴因的提取分離，導(dǎo)致蒂巴因的含量下降。而溶劑過多導(dǎo)致提取液濃度較低，不利于后續(xù)HPLC檢測(cè)，增大測(cè)定結(jié)果的誤差，同時(shí)也會(huì)造成資源浪費(fèi)，所以料液比選用1∶5（g/mL）。

2.4.2 洗脫液的選擇

試驗(yàn)選用HLB固相萃取小柱對(duì)蒂巴因進(jìn)行凈化和富集。在對(duì)小柱的洗脫液方面，分別比較了超純水及體積分?jǐn)?shù)25%，50%，75%和100%甲醇溶液的洗脫效果，結(jié)果以回收率為比較依據(jù)。

如圖3所示，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，蒂巴因的回收率較高，此時(shí)25%甲醇的溶液洗脫能力較強(qiáng)，能較完全地洗脫目標(biāo)物，所以試驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)為25%的甲醇溶液作為樣品的洗脫液。

圖2 不同比例提取液對(duì)蒂巴因的回收率的影響

圖3 洗脫液對(duì)蒂巴因回收率的影響

2.4.3 洗脫液體積的選擇

在上述選用25%甲醇作為HLB固相萃取小柱洗脫液的基礎(chǔ)上，比較了洗脫液體積對(duì)蒂巴因回收率的影響。分別比較了超純水1，2，3，4和5 mL 5種體積對(duì)蒂巴因目標(biāo)物洗脫效果的影響。

如圖4所示，隨著洗脫液體積不斷增加，蒂巴因的回收率逐漸升高，但洗脫液體積達(dá)到3 mL以后再增加洗脫劑體積，蒂巴因回收率并沒有明顯增加，此時(shí)HLB固相萃取小柱中的目標(biāo)物較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積對(duì)蒂巴因的回收率影響不大，所以選擇3 mL為洗脫體積較合適。

圖4 洗脫液體積對(duì)蒂巴因回收率的影響

2.5 加標(biāo)回收與陽(yáng)性樣品

分別添加1.0，10.0和50.0 μg/kg共3個(gè)梯度濃度的蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果見表2。蒂巴因的加標(biāo)回收率范圍為91.5%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1%～6.8%，表明試驗(yàn)所建立的檢測(cè)蒂巴因的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。圖5為陽(yáng)性樣品的色譜圖。

表2 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5） %

圖5 陽(yáng)性樣品的色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)食品中蒂巴因的分析方法。該方法的準(zhǔn)確度和精密度是可行的，前處理選擇用的固相萃取可以縮短前處理時(shí)間，節(jié)約成本。試驗(yàn)結(jié)果表明，在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）體系中，蒂巴因得到了良好的基線分離。樣品在經(jīng)20%乙腈提取后，采用HLB固相萃取柱法以3 mL 25%甲醇作為洗脫溶劑，可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)蒂巴因的凈化與富集。樣品的加標(biāo)回收率在91.5%～94.2%之間，符合檢測(cè)要求。