羽毛角蛋白降解的研究進展

◆作者：彭俏麗 張輝華＊

◆單位：佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院

近年來，隨著我國規(guī)模化養(yǎng)殖模式的推廣，畜禽養(yǎng)殖業(yè)迎來高速發(fā)展，但與此同時也產(chǎn)生了大量的養(yǎng)殖廢棄物，其中包含羽毛、毛發(fā)、蹄等。羽毛中富含角蛋白，角蛋白是一種硬性蛋白，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，很難被直接利用。數(shù)據(jù)顯示，按照羽毛質(zhì)量占活禽總質(zhì)量的5%～7%進行計算，我國每年產(chǎn)生的羽和毛等角蛋白高達數(shù)百萬噸。大量的羽毛的堆積不僅會造成嚴重的環(huán)境污染，還浪費大量的蛋白質(zhì)資源。因此，在生態(tài)環(huán)境要求以及我國蛋白質(zhì)資源短缺的情形下，對羽毛角蛋白的開發(fā)利用具有十分重要的意義。

1 羽毛角蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

角蛋白分為硬角蛋白和軟角蛋白。在兩種不同類型的角蛋白結(jié)構(gòu)中，硫的含量不同，使角蛋白具有更軟或更硬的結(jié)構(gòu)，并在更大程度上影響角蛋白材料的降解。在動物的毛發(fā)、羽毛、鱗片、蹄、鼻、角、爪等結(jié)構(gòu)中普遍存在一種具有很強抗性的硬角蛋白（Dudyński 等,2012），含硫量約占干重的5%；而人表皮中的軟角蛋白含硫量約占干重的1%（Fellahi 等,2016）。

角蛋白一級結(jié)構(gòu)由19 種α- 氨基酸組成，其中氨基酸的組成及其分子結(jié)構(gòu)決定了角蛋白具有不易降解的特性（Brandelli 等,2010）。不同來源的角蛋白，其組成氨基酸的種類和含量也會有所不同。角蛋白二級結(jié)構(gòu)由α- 螺旋或β- 折疊組成。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的差異，可將角蛋白分為α- 角蛋白和β-角蛋白。其中，α- 角蛋白的伸縮性能較好，人和動物毛發(fā)中的角蛋白多屬于此類；β- 角蛋白的抗張性能較好，主要存在于動物的蹄、 角及鳥類羽毛中（Sivakumar 等,2015）。

角蛋白內(nèi)部由于存在分子間的疏水力、氫鍵、鹽鍵，以及不同肽鏈間由胱氨酸殘基所產(chǎn)生的二硫鍵相互高度交聯(lián)形成的三維穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使得角蛋白不溶于水且一般情況下難以被水解。其中，分子間的二硫鍵需要強烈的還原反應才能使其斷裂，而肽鍵需要在高特異性角蛋白酶的作用下才能被水解（Marshall 等,1991）。

2 羽毛角蛋白降解的方法

羽毛中角蛋白含量高達90%，但因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易被降解，造成角蛋白資源極大的浪費（尹紅梅等,2020）。如何有效地降解并利用角蛋白資源就顯得尤為重要。目前，國內(nèi)外常用的角蛋白的降解方法主要是物理（高溫高壓、膨化）降解法、化學（強酸強堿、氧化還原、電化學還原）降解法和生物（酶解）降解法。

2.1 物理降解法

在高溫高壓的條件下，角蛋白中的二硫鍵、氫鍵等結(jié)構(gòu)斷裂，穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，變成可溶性蛋白的方法，稱為物理降解法。包括高溫高壓水解法和膨化法。

2.1.1 高溫高壓水解法

高溫高壓水解法是我國生產(chǎn)羽毛角蛋白飼料的常用方式。利用高溫（100～200℃）和高壓（0.294M～0.98 MPa）將羽毛角蛋白轉(zhuǎn)變成易消化的可溶性多肽混合物，真空干燥后形成羽毛粉（Yin 等,2007）。處理溫度、時間和壓力是影響羽毛粉質(zhì)量的關(guān)鍵因素。但該法所應用的設(shè)備多且降解工藝較為落后，參數(shù)難以控制，產(chǎn)品質(zhì)量得不到保障。另外，持續(xù)的高溫高壓易使得角蛋白嚴重變性，甚至會造成部分氨基酸的損失。同時，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的“三廢”問題易對環(huán)境造成污染。

2.1.2 膨化法

膨化法與高溫高壓水解法不同。膨化法在高溫（230 ℃）高壓（1.0M～1.5MPa）高剪切力的基礎(chǔ)上，進行快速（2.5 min）減壓膨化，破壞角蛋白的空間結(jié)構(gòu)，形成的肽鏈易于被動物消化吸收（王晶，2007）。該工藝較水解法簡單，設(shè)備少、成本低、污染少。但由于膨化過程使得二硫鍵斷裂造成半胱氨酸的利用率降低。因此在實際應用過程中，常與酶處理法聯(lián)合應用，以達到提高角蛋白利用率的目的。

2.2 化學降解法

利用酸或堿或氧化還原等方法，破壞二硫鍵，使不溶性角蛋白成為可溶性蛋白質(zhì)的方法稱之為化學降解法（Coward-Kelly 等,2006）。包括酸堿水解法、氧化還原降解法和電化學還原法。

2.2.1 酸堿水解法

利用強酸或強堿處理角蛋白，破壞其穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，從而獲得可溶性的角蛋白。該種方法要求適宜的酸堿濃度、反應溫度和反應時間，其中反應時間對產(chǎn)品分子量的大小和產(chǎn)率具有重要影響（賈如琰等，2008）。但是酸堿水解法對氨基酸的破壞較為嚴重，同時產(chǎn)生過多的鹽分，不利于動物的生長。另外，在生產(chǎn)過程中容易腐蝕金屬，對水體和土壤的污染較為嚴重。

2.2.2 氧化還原降解法

利用氧化劑將角蛋白中的二硫鍵氧化成磺酸基，使不溶性的角蛋白水解成可溶性的蛋白質(zhì)的方法稱之為氧化法。氧化過程中肽鏈易斷裂，因此氧化法不易獲得高分子量產(chǎn)品。氧化劑一般為過氧化物，如過氧化氫、過甲酸、過乙酸等。

利用還原劑將角蛋白中的二硫鍵還原成巰基，使不溶性的角蛋白水解成可溶性的蛋白質(zhì)的方法稱之為還原法。與氧化法不同，還原法在還原過程中對肽鏈的影響較小，所獲得的產(chǎn)品不僅分子量大，而且產(chǎn)率較高，是當前最常用的化學方法。還原劑一般為巰基化合物，如巰基乙酸、巰基乙酸鈉等。但巰基的性質(zhì)較為活潑，要獲得穩(wěn)定的角蛋白產(chǎn)品，還需添加保護劑避免巰基被氧化。常用的保護劑為鼠李糖脂或表面活性劑等，其中表面活性劑可提高角蛋白的可溶性，提高動物的消化率（Ozdemir 等，2006）。

2.2.3 電化學還原法

利用電解液，使角蛋白發(fā)生氧化還原反應的方法稱為電化學還原法。電解槽接通電源后，角蛋白發(fā)生還原反應，使得二硫鍵斷裂形成巰基，巰基與電解液中的其他離子進行結(jié)合以避免再次氧化（賈如琰等，2008）。通過反復的滲透、透析之后獲得可溶的角蛋白。但該法過程較為復雜，且產(chǎn)物不純。

2.3 離子液體降解法

離子液體是指全部由離子組成的液體，它具有不燃、無味、可循環(huán)利用、蒸汽壓低、不揮發(fā)等特點（Idris 等，2013）。在不同陰陽離子結(jié)構(gòu)的離子液體中，微波加熱條件下，大分子之間的極性變強，分子之間化學鍵的劇烈震動使得角蛋白中的二硫鍵和氫鍵發(fā)生斷裂而溶解，這種方法稱為離子液體降解法。值得注意的是，角蛋白溶解效率較高，且并未發(fā)生任何的化學反應。因此，離子液體降解法具有較好的發(fā)展前景。

2.4 生物降解法

利用微生物或者角蛋白酶對角蛋白進行處理，使其空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而增加角蛋白溶解性的方法稱之為生物降解法，又稱酶解法。角蛋白酶是一類能降解角蛋白的酶，具有專一性。目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)角蛋白酶的微生物主要有真菌、細菌和放線菌。

2.4.1 產(chǎn)酶菌的種類

2.4.1.1 真菌

早期記錄的產(chǎn)角蛋白酶的真菌是1899 年Ward 發(fā)現(xiàn)的馬爪甲團囊菌（Onygena equina），同時這也是人類最早發(fā)現(xiàn)的能夠?qū)堑鞍走M行降解的微生物（Agrawal 等,1980）。之后人們逐漸從禽類羽毛、土壤或污泥中分離出來多種可降解角蛋白的真菌，如小孢子菌（Microsporum）、發(fā)癬菌（Trichophyton）、須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、白色念珠菌（Canida albicans）、許蘭毛癬菌（Trichophyton schoenleinii）、Soprophytes、Dermatophyte 和Scopulariopsis brevicaulis 等，但由于絕大部分屬于致病性的皮膚真菌，用處不大。也有不少其他真菌，如黃曲霉，但由于黃曲霉產(chǎn)生毒素，從而抑制了其在降解角蛋白方面的應用。與黃曲霉不同，微孢長囊頭孢霉菌不僅不產(chǎn)生毒素，還能很好地降解人體角質(zhì)層（Gradisar等,2000）。 另外，Trichoderma，Alternaria，Curvularia，Penicilium等也有較好的降解效果。

2.4.1.2 細菌

早期記錄的可產(chǎn)角蛋白酶細菌是1990 年Williams 等人發(fā)現(xiàn)的地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis PDW-1（Williams等，1990）。目前發(fā)現(xiàn)的可產(chǎn)角蛋白酶的細菌多為芽孢桿菌，其中又屬地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌最多。除上述的地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis PDW-1外，還有如枯草芽孢桿菌BS8（何周鳳等，2015）、枯草芽孢桿菌KD-N2（ZHENG 等，2008）等。細菌菌屬也逐漸引起了人們的注意，如芽孢八疊球菌GIMN1.015（顧振紅等，2013）、藤黃微球菌B1pz（Wojciech 等，2015）、金 黃色節(jié)桿菌N01（周童娜等，2015）等。另外，部分嗜熱耐堿的細菌在工業(yè)生產(chǎn)中具有極大優(yōu)勢，展現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭，如Fervidobacterium （Nam 等，2002），Nesternkonia （Gessesse 等 ，2003），Thermoanaerobacter（Kublanov 等，2009）等。

2.4.1.3 放線菌

早期記錄的可產(chǎn)角蛋白酶放線菌是1958 年Nickerson 等人發(fā)現(xiàn)的弗氏鏈霉菌（Nickerson 等，1959）。放線菌一般具有較強的降解角蛋白的能力，且大多屬于鏈霉菌屬。如鏈霉菌菌株16（Xie 等,2010）、鏈霉菌Streptomycesgulbargensis（Koutchma 等，2009）、嗜熱的禾生鏈霉菌Thermotolerant Streptomyces graminofacients（Szabó 等，2000）等。

2.4.2 酶解機理

普遍認為，微生物降解角蛋白的過程主要分為三個步驟：變性作用、水解作用和轉(zhuǎn)氨基作用。

（1）變性作用

角蛋白變性是角蛋白降解的第一步，而二硫鍵的斷裂是角蛋白變性的關(guān)鍵。關(guān)于二硫鍵的斷裂有多種說法：通過胱氨酸的直接還原而變性（Kunert 等，1989）；利用還原劑如巰基乙酸鹽、二硫蘇糖醇等使二硫鍵打開；角蛋白酶本身含有二硫鍵還原酶，它首先作用于角蛋白二硫鍵，使角蛋白變性（涂國全等,1998）。但值得注意的是，有研究表明在角蛋白降解時并未檢測出巰基的存在（Sherine 等，1997）。另外，角蛋白酶是否含有二硫鍵還原酶或含有的二硫鍵還原酶是否具有活性，目前還未能證明。

（2）水解作用

蛋白質(zhì)變性后喪失其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在角蛋白酶等的作用下，逐漸被水解為寡肽、多肽和游離氨基酸（涂國全等，1998）。

（3）轉(zhuǎn)氨基作用

研究表明，角蛋白被水解為肽類和游離氨基酸之后，通過轉(zhuǎn)氨基作用將角蛋白中的氮轉(zhuǎn)化成氨氣，這種轉(zhuǎn)氨基作用在微生物降解過程中，常被稱為氮源的削減現(xiàn)象（Kunert 等，1989）。

2.4.3 酶解的影響因素

微生物降解角蛋白過程受到諸多因素的影響。不同溫度和pH 對不同的角蛋白酶活性均有所差異，進而影響酶解的效率。另外，蛋白質(zhì)的變性對酶解具有關(guān)鍵作用，同時，微生物降解角蛋白過程中的氮源削減現(xiàn)象不容忽視。因此，酶解的影響因素主要有溫度、pH、還原劑、金屬離子和碳源氮源等。

大多數(shù)角蛋白酶的最適溫度介于30～70℃。由于角蛋白酶的自解，部分角蛋白酶活性會隨著反應溫度的升高或降低而有所改變，如：Streptomyces gulbargensis DAS 131 角蛋白酶（Koutchma 等，2009）；部分角蛋白則適宜更低或更高的溫度而不影響其穩(wěn)定性，如：寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）D1 最適溫度為20℃、Fervidobacterium islandicum AW-1 最適溫度為100℃（Lee 等，2015）。另外，弧菌科的最適生長溫度（30℃）與其所生產(chǎn)角蛋白酶的最適溫度（55℃）并不一致。大多數(shù)角蛋白酶的最適pH 介于7.0～10.0。如短小芽孢桿菌所產(chǎn)生的角蛋白酶最適pH 為9.0。部分人體腐生真菌所產(chǎn)角蛋白酶適宜較低的pH，如Trichophyton schoenleinii所產(chǎn)生的角蛋白酶最適pH 為5.5（Qin 等,1992）。實驗表明，只有角蛋白變性之后，角蛋白酶才能發(fā)揮作用。還原劑如巰基乙醇等可將角蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂，使角蛋白高級結(jié)構(gòu)解體，為角蛋白酶發(fā)揮水解功能提供條件，提高水解效率。但應考慮還原劑是否會作用于角蛋白酶中的二硫鍵，避免產(chǎn)生負效應。另外，不同的金屬離子對角蛋白的降解影響具有差異性。低濃度的Ca2+、Mg2+等二價金屬離子有利于促進角蛋白酶的活性，但Hg2+、Pb2+等則抑制其活性。碳源或氮源的添加也會導致角蛋白降解效率降低。

3 羽毛角蛋白的應用

3.1 動物飼料

蛋白質(zhì)是動物生長發(fā)育必需的三大營養(yǎng)物質(zhì)之一，常見的蛋白質(zhì)飼料有魚粉、大豆以及豆粕等。而中國蛋白質(zhì)飼料較為缺乏，蛋白質(zhì)資源短缺是制約中國養(yǎng)豬行業(yè)的一大重要因素。數(shù)據(jù)顯示，2020 年1-3 月中國大豆進口量達到1779 萬噸，相比上年同期增長了104 萬噸，累計增長6.2%，交易金額達7187.3 百萬美元。角蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的天然蛋白，而羽毛中含有90%左右的角蛋白，同時包含大量半胱氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺等氨基酸、常量元素、微量元素、維生素以及一些未知生長因子，其中胱氨酸是天然蛋白飼料中含量最高的（Saravanan 等 ,2012; Tseng,2011）。研究發(fā)現(xiàn)，生物技術(shù)提取的羽毛角蛋白的體外消化率可達98.5%，與大豆蛋白僅差1.0%（Grazziotin 等,2006）。我國每年的廢棄羽毛多達數(shù)百萬噸，利用角蛋白酶水解角蛋白制成動物飼料，不僅高效，而且能耗較少，更經(jīng)濟環(huán)保。

3.2 醫(yī)藥

羽毛角蛋白具有較好的生物相容性、細胞親和性和生物可降解性，在生物醫(yī)藥方面具有較多的應用。比如將羽毛角蛋白降解為可溶性蛋白質(zhì)后，與其他高分子材料形成高分子聚合物，應用于醫(yī)藥制品、人工支架等；制備生物凝膠用于神經(jīng)缺損修復；制備角蛋白膜作為藥物載體等。另外，還可利用角蛋白獲取復合氨基酸溶液，替代部分人血漿，用于肝病的治療等。

3.3 肥料

氮、磷、鉀統(tǒng)稱為“肥料三要素”，其中氮肥被稱為植物的基本元素，可提高作物產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常用的是糞肥，而我國羽毛廢棄物量多易得，經(jīng)加工后羽毛粉含氮量為5%，可替代較昂貴的糞肥。利用角蛋白可獲取氨基酸螯合劑，提高農(nóng)作物對微量元素的利用率（許立和,2002）。另外，有研究表明，酶解后的羽毛具有良好的肥力效果，可用于生產(chǎn)液體氨基酸復合肥（Suh 等,2005），有利于提高作物產(chǎn)量，降低成本。

4 結(jié)語

我國每年有大量的廢棄羽毛，羽毛中含有約90%的角蛋白。羽毛角蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的天然蛋白質(zhì)資源，但由于二硫鍵、氫鍵等的作用使得角蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定而難以降解，往往造成資源浪費，環(huán)境污染。目前常用物理和化學降解法，降解的效率較為低下，工藝復雜，能量損耗大，且污染環(huán)境。而生物降解法能有效地改善上述問題，更為高效環(huán)保。另外，生物降解角蛋白在動物飼料、醫(yī)藥和肥料等方面具有極大的應用價值，一定程度上可以解決我國蛋白飼料資源短缺的問題，促進醫(yī)療和農(nóng)業(yè)的發(fā)展。